Examinando por Autor "Casati, Paula"
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Ítem Acceso Abierto Efecto del daño al ADN por UV-B en plantas: estudio de la interacción de proteínas remodeladoras de la cromatina y el sistema de reparación de bases incorrectamente apareadas(2013) Lario, Luciana Daniela; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.La luz es uno de los factores más importantes que regulan el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Sin embargo, el aumento de la radiación UV-B, debido a la acción antropogénica, puede tener un impacto negativo en los cultivos, debido a una disminución de la producción de biomasa. A nivel molecular, esta radiación provoca lesiones en el ADN, las cuales, si no son reparadas, perturban el metabolismo celular al impedir que ocurran los procesos de transcripción y replicación del genoma. Por tal motivo, los organismos eucariotas han desarrollado eficientes mecanismos de reparación del ADN, y han coordinando estos procesos con el remodelado de la cromatina y con la regulación del progreso del ciclo celular. El este trabajo de Tesis, se procedió a analizar la respuesta de las plantas frente al daño producido en el ADN por la radiación UV-B. En primer lugar, se encontró que los genes codificantes del heterodímero MutSα (MSH2 y MSH6), y de las chaperonas de histona ASF1 (ASF1A y ASF1B), se inducen en presencia de UV-B, y estarían involucrados en la reparación de CPDs. Además, se observó que MSH2 participaría en la señalización del arresto del ciclo celular, en respuesta al daño producido en el ADN por esta radiación. Por otra parte, se corroboró que los genes ASF1 y MSH se encuentran regulados por el ciclo celular, presentando un máximo de expresión durante la fase S. Además, se determinó que MSH6, ASF1A y ASF1B son blancos de regulación de los factores de transcripción E2F, y que la expresión de algunos de dichos factores (E2Fa-E2Fd), a su vez, se modula por la radiación UV-B. Finalmente, mediante ensayos de coinmunoprecipitación, se encontró que las proteínas ASF1 interaccionan con las histonas H3 y H4 acetiladas en sus extremos N-terminales, y con las proteínas acetiltransferasas HAM1/HAM2, cuyo homólogo en humanos, denominado Tip60, se encuentra involucrado en la activación del arresto del ciclo celular y en la reparación del ADN en respuesta al estrés genotóxico. Estos resultados confirman la regulación coordinada de los genes involucrados en la reparación del ADN, el remodelado de la cromatina, y el arresto del ciclo celular, en respuesta al daño al ADN provocado por la radiación UV-B en plantas.Ítem Embargo Estudio de los mecanismos que participan en las vías de respuesta a la radiación UV-B en plantas de Arabidopsis thaliana(2022) Giustozzi, Marisol; Casati, PaulaLa radiación solar es de máxima importancia para las plantas, tanto como fuente de energía como señal medio ambiental regulando el crecimiento y desarrollo. La radiación ultravioleta A y B (UV-A y UV-B) forma parte de la radiación que alcanza la superficie terrestre. Las plantas por su condición de sésil están expuestas a la radiación UV-B, que provoca lesiones en las macromoléculas tales como ADN, ARN, proteínas y lípidos. En particular, la absorción de esta radiación por el ADN induce la formación de enlaces covalentes entre pirimidinas adyacentes, dando lugar a dímeros de pirimidina por formación de anillos de ciclobutano (CPD) y, en menor medida, fotoproductos pirimidinapirimidona. Luego de la exposición a la radiación UV-B, fenotípicamente se observa reducción en la biomasa, disminución en la altura y el área foliar y la producción de compuestos fotoprotectores como consecuencia del daño en el ADN. La reparación del daño en el ADN causada por la radiación UV-B es esencial para la supervivencia de los organismos. Existen diferentes mecanismos por los cuales las plantas reparan el daño en el ADN, entre ellas, la fotoreactivación, en la cual a través de la energía de la luz visible se revierte el daño. Por otro lado, las vías de reparación “oscuras” no revierten el daño, sino que reemplazan el ADN dañado, incluyendo el sistema de reparación por escisión de nucleótidos (NER). Existen dos vías del sistema NER, que son la reparación genómica global que remueve las lesiones del ADN del genoma en general, y la reparación acoplada a la transcripción, la cual remueve las lesiones del ADN que interfieren con la progresión de la ARN. La subunidad 17 del Complejo Mediador (MED17) fue estudiada tanto en levaduras como en humanos, donde se determinó que interacciona con proteínas del sistema NER, actuando entre la transcripción y la reparación del daño en el ADN. En esta tesis se demostró que la subunidad 17 del Complejo Mediador es un importante regulador en la respuesta al daño en el ADN luego de la exposición a la radiación UV-B en plantas de Arabidopsis thaliana. En particular, MED17 modula transcripcionalmente la expresión de genes de la vía de la respuesta al daño en el ADN y al UV-B. Además, se demostró que interacciona con factores de iniciación de la transcripción y proteínas asociadas a la cromatina que podrían facilitar la reparación del ADN. También se evidenció que la interacción de MED17 con ATR y PDCD5 durante la respuesta al daño en el ADN podría estar regulando la expresión de proteínas de la vía, además podría actuar en el reconocimiento del daño en el ADN a través de la unión de proteínas de reparación en el ADN. A su vez, para la reparación del ADN, es importante la actividad de enzimas que remodelan la cromatina, por ejemplo, la acetilación de las histonas. Estudios previos de nuestro laboratorio demostraron que plantas de maíz deficientes en la expresión de la proteína MBD101 presentaron una cromatina más laxa, mostrando una mayor sensibilidad a la radiación UV-B con un mayor daño en el ADN luego del tratamiento (Qüesta y col; 2015). Además, se observó la interacción de MBD101 con la histona H4, lo que podría indicar un rol en la compactación de la cromatina (Qüesta y col.; 2010). En Arabidopsis thaliana, las proteínas MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 y MBD12 presentan homología con la proteína MBD101. En este trabajo de tesis se demostró que las proteínas MBD1, MBD2, MBD3, MBD4 están involucradas en la respuesta tanto al estrés UV-B como salino.Ítem Acceso Abierto Estudio del efecto de la radiación UV-B en plantas(Universidad Nacional de Rosario, 2017-05-19) Fina, Julieta Paola; Casati, PaulaCapítulo 1: “Estudio del rol de enzimas que participan en la acetilación de histonas en las respuestas frente a la radiación UV-B en plantas de Arabidopsis thaliana” Arabidopsis thaliana posee cuatro familias de histonas acetiltransferasas, la familia GNAT que posee 3 miembros denominados HAG1, HAG2 y HAG3; la familia MYST que posee 2 miembros, HAM1 y HAM2; la familia p300/CBP que posee 5 miembros denominados HAC1, HAC2, HAC4, HAC5 y HAC12; y la familia TAFII250, que posee 2 miembros, HAF1 y HAF2. En este trabajo de Tesis, la utilización de plantas de Arabidopsis thaliana con niveles nulos o disminuidos de las histonas acetiltransferasas de las familias HAG, HAC y HAF nos permitió demostrar que las histonas acetiltransferasas HAG3, HAF1 y HAC1 tienen diferentes roles durante la exposición de las plantas a la radiación UV-B, debido a que regulan la expresión de genes de respuesta al UV-B que son necesarios para el desarrollo de las mismas en respuesta a esta radiación. Capítulo 2: “Estudio del crecimiento de la hoja de plantas de maíz expuestas al UV-B solar” En Argentina, la producción agropecuaria es uno de los ejes de la economía, siendo el maíz uno de los principales cultivos. En trabajos anteriores se demostró que la radiación UV-B inhibía el crecimiento de las hojas de maíz. En este trabajo de Tesis, demostramos que los niveles de radiación UV-B presentes en la radiación solar inhiben el crecimiento de las hojas de maíz como consecuencia de una disminución en la producción celular; y esta respuesta está mediada, en parte, por el factor de transcripción ZmGRF1.Ítem Acceso Abierto Estudio del rol de distintas enzimas que participan en la vía de síntesis de flavonoides en la respuesta a la radiación UV-B en plantas(2014) Emiliani, Julia; Casati, Paula; Falcone Ferreyra, María LorenaLos flavonoides son metabolitos secundarios con diversas funciones biológicas, distribuidos de forma ubicua en el reino vegetal. Formas primitivas de estos compuestos posiblemente acompañaron la adaptación de las plantas a la superficie de la Tierra. En particular, un subgrupo de estos metabolitos, los flavonoles, participan en la regulación del transporte de auxinas y son esenciales para la macho esterilidad en algunas especies vegetales. En este trabajo de Tesis, la utilización de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con mayores niveles de flavonoles, permitió demostrar mediante experimentos de acumulación de daño en el ADN, actividad fotosintética, daño a las membranas e inhibición de la elongación de la raíz primaria luego de un tratamiento con UV-B, que estos metabolitos cumplen roles protectores en las plantas frente a un tipo de estrés abiótico como la radiación UV-B; ejercido como efectivos filtros UV-B y/o debido a sus propiedades antioxidantes. Otro subgrupo de flavonoides se encuentra constituido por las flavonas producidas a partir de las flavanonas. En este trabajo de Tesis, mediante la expresión recombinante en sistemas heterólogos y análisis de LCMS, se logró caracterizar por primera vez en maíz, dos enzimas con capacidad de sintetizar flavonas; una de ellas caracterizada como una flavanona 2-hidroxilasa (ZmF2H1) y la otra, como una enzima flavona sintasa I (ZmFNSI-1). Además, fue posible también demostrar que una especie Brasicácea como Arabidopsis contiene en su genoma un gen codificante a una enzima FNSI (AtFNSI-1) con capacidad de producir flavonas con un rol no identificado hasta el momento frente al ataque del patógeno oomicete Hyaloperonospora parasítica, un hecho nunca antes visto en esta especie vegetal.Ítem Acceso Abierto Estudios sobre la expresión y estructura de la enzima málica NADP dependiente de plantas con distintos metabolismos fotosintéticos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 1998-12-23) Casati, Paula; Andreo, Carlos SantiagoLos resultados obtenidos al estudiar el posible rol fisiológico y las propiedades cinéticas y estructurales de la enzima málica dependiente de NADP purificada de trigo sugieren la existencia de una única isoforma de 72 kDa en los tejidos de esta especie C3. Esta enzima fue purificada a homogeneidad a partir de tallos y raíces de trigo y con ella se realizaron estudios cinéticos. La enzima no presenta histéresis. Los valores obtenidos de pH óptimo coinciden con los anteriormente descriptos para otras enzimas de plantas C3 y CAM y difieren con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática fue absolutamente dependiente de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+), mostrando cinéticas de saturación no hiperbólicas como sucede con la EM-NADP de plantas C4. Por otra parte, las curvas de saturación obtenidas en función da la concentración de NADP y L-malato fueron hiperbólicas. La actividad de EM-NADP fue inducida por tratamiento con celulasa macerosima y glutatión, y este aumento fue asociado con aumentos de proteína determinado a partir de Western blots. Estos resultados sugieren que la EM-NADP de plantas C3 podría estar involucrada en la biosíntesis de lignina relacionada con respuestas de defensa de la planta, proveyendo de NADPH a los dos pasos dependientes de NADPH de la biosíntesis de monolignol. Las EM-NADP de maíz y de trigo se disocian en un medio acidico y bajas temperaturas de manera secuencial siguiendo el orden T-D-M. Las entalpías para los equilibrios fueron negativas, pero el proceso total provoco un cambio de energía libre estándar positiva siendo la entropía del sistema un factor importante en ambos equilibrios. La presencia de Mg2+, NADP y L-malato modifican los equilibrios entre M, D y T dependiendo de la fuente enzimática. El catión indujo la agregación de ambas enzimas hacia la forma tetramerica, mientras que el L-malato no modifico el estado oligomérico de la EM-NADP de ambas fuentes. El NADP no cambio el estado multimérico de la enzima de maíz aunque la enzima de trigo se asoció en presencia de la coenzima. Por último, el glicerol estabilizo la forma tetramerica en ambos sistemas, mientras que un aumento en la fuerza iónica favoreció la disociación de la estructura oligomérica de la EM-NADP. Estos resultados favorecen la idea de que la EM-NADP de maíz y de trigo existiría en varios estados oligoméricos (M, D y T) in vivo y que este proceso de asociación-disociación podría estar mediada por la concentración de metabolitos en el medio, condiciones de luz, fuerza iónica y el pH. La actividad de la enzima málica dependiente de NADP fue inducida por radiación UV-B, al igual que el contenido proteico y el ARNm a casi el mismo nivel que por altos niveles de luz blanca dependiendo de la intensidad de la luz y la duración del tratamiento. El efecto de la radiación UV-B fue también eficaz cuando se administraron pequeñas dosis de UV-B seguidas por un tratamiento de oscuridad. La luz roja fue efectiva en la inducción de EM-NADP, de manera similar a la radiación UV-B, administrada tanto en forma continua como por periodos cortos. Nuestros resultados también muestran también que luego de una exposición corta bajo luz roja lejana aplicada inmediatamente después de los pulsos de luz UV-B o roja el efecto inductivo sobre la enzima málica se reduce significativamente, y el efecto de la luz roja lejana se revierte por un pulso final con luz roja o UV-B. De esta manera proponemos que elevados niveles de EM-NADP podrían proveer a las plantas con mayor cantidad de poder reductor para reparar a la célula y además aumentar el contenido de piruvato y NADPH para la respiración mitocondrial. Las especies C3 de Flaveria poseen baja actividad de EM-NADP, que es principalmente atribuida a la forma de mayor masa molecular de la enzima, mientras que las especies C4 de Flaveria poseen muy altas actividades de EM-NADP en hojas atribuible a la presencia en forma mayoritaria de la isoforma de baja masa molecular. La isoforma de mayor masa molecular en las especies de Flaveria C3 parece poseer una mayor Km para el NADP que la forma de menor masa molecular de las especies de Flaveria C4. Los Western blots realizados con extractos proteicos de hojas de distintas especies C3 muestran que la banda inmunoreactiva mayoritaria es el monómero de 72 kDa y presenta bajos niveles de las formas de menor masa molecular (62 y 64 kDa), mientras que las especies de Flaveria C4 muestran una banda muy reactiva de 62 kDa de la EM-NADP, y bandas menores de 64 y 72 kDa. En las especies C3 y C4 existen hasta tres formas monoméricas de la enzima de 62, 64 y 72 kDa, y la cantidad relativa de cada forma puede variar entre los intermediarios. En hojas de especies similares a C4, existen dos bandas predominantes (62 y 64 kDa), estando la forma de 72 kDa presente en muy bajos niveles. En conjunto, todos estos resultados demuestran la presencia de 3 isoformas de la EM-NADP con diferentes masas moleculares en Flaveria, un aumento en la expresión de las forma de 64 kDa desde las especies C3 hasta las similares a C4, y un aumento en la expresión de la forma de 62 kDa y una disminución de la expresión de la forma de 72 kDa desde las especies C3 hasta las C3-C4, similar a C4 y las C4. La EM-NADP se localiza principalmente en los cloroplastos, tanto en células mesofilicas de las plantas C3 y en ambos tipos de células fotosintéticas en las otras especies siendo mayoritaria la marca en células de la vaina vascular en las especies C4. En especies intermedias, la marca mayoritaria se encontró en los cloroplastos de la vaina vascular mientras que una marca significativa también se observó en cloroplastos mesofilicos. Se observaron tres formas activas de la EM-NADP en hojas de la especie intermediaria C3-C4 F. floridana que se diferencian por masa molecular y puntos isoeléctricos nativos. La EM-NADP se encuentra parcialmente compartamentalizada en los distintos tipos de células fotosintéticas, obteniéndose una mayor actividad específica y una mayor expresión de las formas de 64 y 62 kDa en la fracción correspondiente a los cloroplastos de la vaina vascular. La forma purificada de 62 kDa presenta propiedades cinéticas intermedias entre las enzimas málicas de plantas C3 y C4. La enzima exhibe un máximo de actividad a pH 7,5 de manera similar a lo observado con otras enzimas de plantas C3 y CAM y difiriendo con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática depende de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+). Las cinéticas de saturación obtenidas para NADP y L-malato fueron hiperbólicas y no se observó inhibición por L-malato a pH 7,0, difiriendo al comportamiento de plantas C4 e indicando que la enzima presenta características intermedias. En resumen, la forma purificada representa una forma enzimática no descripta hasta el presente.Ítem Acceso Abierto Optimization of protease production and sequence analysis of the purified enzyme from the cold adapted yeast Rhodotorula mucilaginosa CBMAI 1528(Elsevier, 2020-10-21) Lario, Luciana Daniela; Pillaca-Pullo, Omar Santiago; Sette, Lara Durães; Converti, Attilio; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.; Pessoa, AdalbertoEnzymes from cold-adapted microorganisms are of high interest to industries due to their high activity at low and mild temperatures, which makes them suitable for their use in several processes that either require a supply of exogenous energy or involve the use of heat labile products. In this work, the protease production by the strain Rhodotorula mucilaginosa CBMAI 1528, previously isolated from the Antarctic continent, was optimized, and the purified enzyme analyzed. It was found that protease production was dependent on culture medium composition and growth temperature, being 20 C and a culture medium containing both glucose and casein peptone (20 and 10 g/L, respectively) the optimal growing conditions in batch as well as in bioreactor. Moreover, mass spectrometry analysis revealed that the enzyme under study has a 100 % sequence identity with the deduced amino acid sequence of a putative aspartic protease from Rhodotorula sp. JG-1b (protein ID: KWU42276.1). This result was confirmed by the decrease of 95 % proteolytic activity by pepstatin A, a specific inhibitor of aspartic proteases. We propose that the enzyme reported here could be Rodothorulapepsin, a protein characterized in 1972 that did not have an associated sequence to date and has been classified as an orphan enzyme.Ítem Acceso Abierto P1 epigenetic regulation in leaves of high altitude maize landraces: effect of UV-B radiation(Frontiers Media, 2016-04-21) Rius, Sebastián P.; Emiliani, Julia; Casati, PaulaÍtem Acceso Abierto Respuestas de las plantas frente a la radiación UV-B: reparación del daño al ADN, regulación de la expresión génica y de la progresión del ciclo celular(2019) Gomez, María Sol; Casati, Paula; Falcone Ferreyra, María LorenaLa radiación UV-B es la forma más energética de luz solar que alcanza la superficie terrestre, y a la que las plantas se encuentran inevitablemente expuestas. Dosis elevadas de UV-B, como las que se perciben durante el verano, producen daño en diversas biomoléculas y afectan el crecimiento de las plantas. En particular, la inhibición del crecimiento de las hojas se debe a que el UV-B afecta los procesos de proliferación y/o expansión celular, como consecuencia, en parte, del daño que produce en el ADN. En Arabidopsis thaliana existen diversas vías que controlan estos procesos, aunque la participación de la mayoría de ellas en las respuestas al UV-B, así como la presencia de una conexión entre las mismas, aún no han sido dilucidadas. Conjuntamente, el remodelado de la cromatina es un proceso fundamental en la respuesta al daño en el ADN. El complejo CAF-1, una chaperona de histonas de tipo H3/H4, participa en la reparación del daño al ADN, en los procesos de recombinación y en el control de la expresión de diversos genes. Si bien se ha descripto su participación en la respuesta al estrés causado por diferentes agentes genotóxicos, aún no se ha estudiado si interviene en las respuestas al UV-B. En este trabajo de Tesis se demostró que los factores de transcripción E2Fb y E2Fc, pertenecientes a la vía del Retinoblastoma, participan de la regulación del crecimiento de Arabidopsis luego de la exposición al UV-B a través de mecanismos diferentes, aunque ambos regulan de manera antagónica la expresión de E2Fe, otro factor de transcripción cuya participación en la respuesta al UV-B ya ha sido dilucidada. Por un lado, E2Fc regula la expresión de genes de respuesta al daño en el ADN y actúa de manera epistática sobre el microARN 396, el cual también interviene en la regulación del crecimiento de las hojas bajo condiciones de iluminación con UV-B. Por otro lado, E2Fb contribuye, en parte, con las respuestas al UV-B mediadas por E2Fe, al regular el inicio del endociclo. En lo que respecta a CAF-1, se determinó mediante la utilización de líneas de Arabidopsis deficientes en la actividad de este complejo, que cumple funciones diferentes en las hojas y en las raíces en respuesta a la radiación UV-B. Esto puede deberse a que la participación de CAF-1 en los mecanismos de respuesta a este tipo de estrés sea específica para cada tipo de tejido. En conclusión, los resultados obtenidos indican que existe una compleja red regulatoria para mantener el crecimiento de las plantas en función de las condiciones ambientales, y en particular frente a niveles incrementados de radiación UV-B.Ítem Acceso Abierto Ribosomal protein RPL10A contributes to early plant development and abscisic acid-dependent responses in Arabidopsis(Frontiers Media, 2020-11-05) Ramos, Rocío Soledad; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.; Falcone Ferreyra, María LorenaÍtem Acceso Abierto Transcriptional and metabolic changes associated to the infection by fusarium verticillioides in maize inbreds with contrasting ear rot resistance(Public Library of Science (PLOS), 2013-04-18) Campos Bermúdez, Valeria Alina; Fauguel, Carolina M.; Tronconi, Marcos A.; Casati, Paula; Presello, Daniel A.; Andreo, Carlos SantiagoFusarium verticillioides causes ear rot and grain mycotoxins in maize (Zea mays L.), which are harmful to human and animal health. Breeding and growing less susceptible plant genotypes is one alternative to reduce these detrimental effects. A better understanding of the resistance mechanisms would facilitate the implementation of strategic molecular agriculture to breeding of resistant germplasm. Our aim was to identify genes and metabolites that may be related to the Fusarium reaction in a resistant (L4637) and a susceptible (L4674) inbred. Gene expression data were obtained from microarray hybridizations in inoculated and non-inoculated kernels from both inbreds. Fungal inoculation did not produce considerable changes in gene expression and metabolites in L4637. Defense-related genes changed in L4674 kernels, responding specifically to the pathogen infection. These results indicate that L4637 resistance may be mainly due to constitutive defense mechanisms preventing fungal infection. These mechanisms seem to be poorly expressed in L4674; and despite the inoculation activate a defense response; this is not enough to prevent the disease progress in this susceptible line. Through this study, a global view of differential genes expressed and metabolites accumulated during resistance and susceptibility to F. verticillioides inoculation has been obtained, giving additional information about the mechanisms and pathways conferring resistance to this important disease in maize.