Browsing by Author "De Mendoza, Diego"
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Item Caenorhabditis elegans como modelo para estudiar el metabolismo de colesterol : autofagia y efecto del aceite de kril(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2019-03-25) Battista, Bernabé; De Mendoza, Diego; Prez, GastónEl nematodo Caenorhabditis elegans es una poderosa herramienta para el estudio de diversas patologías. En nuestro laboratorio, se estudia como diferentes lípidos afectan el transporte de colesterol y su rol en el desarrollo reproductivo del gusano. El control del transporte de colesterol es crucial para la homeostasis fisiológica en la mayoría de las células eucariotas. Entre otros factores, el metabolismo del colesterol se encuentra asociado al proceso de reciclaje de componentes celulares conocido como autofagia. Se ha reportado que desregulaciones de la misma se asocian a diferentes enfermedades y desórdenes metabólicos. En este trabajo se estudio la influencia del metabolismo del colesterol sobre la autofagia en C. elegans. Encontrándose que la ausencia del colesterol produce una disminución del flujo autofágico y que el agregado externo del endocanabinoide 2-araquidonoil glicerol (2AG) restituye parcialmente el mismo. Asimismo se estudió el efecto del aceite de kril suplementado en la dieta, sobre la formación de dauers en cepas mutantes de C. elegans. Se descubrió que el aceite de kril contiene compuestos lipídicos que aumentan o inhiben la formación de dauers en C. elegans.Item Cannabinoids activate the insulin pathway to modulate mobilization of cholesterol in C. elegans(Public Library of Science, 2022-11) Hernández Cravero, Bruno; GallinoI, Sofía; Florman, Jeremy; Vranych, Cecilia; Diaz, Philippe; Elgoyhen, Ana Belén; AlkemaI, Mark J.; De Mendoza, DiegoItem Caracterización estructural y funcional del termosensor DesK de Bacillus subtilis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-03-28) Saita, Emilio Adolfo; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela. subtilis se adapta rápidamente a disminuciones de temperatura mediante un mecanismo denominado vía Des, el cual es controlado por el sistema de dos componentes DesK/DesR. El termosensor DesK es el encargado de detectar cambios en la temperatura ambiental y regular la transcripción del gen des que codifica para una Δ5 acil lípido desaturasa, la cual genera insaturaciones en los ácidos grasos de los fosfolípidos de la membrana plasmática modificando la fluidez de la misma. En este trabajo de tesis nos propusimos estudiar los eventos moleculares que tienen lugar en los segmentos transmembrana (TM) de DesK durante la detección de la señal de temperatura. La estrategia inicial que decidimos aplicar es la marcación de spin sitio-dirigida y posterior medición por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Dicha estrategia implica la unión de una sonda de spin a residuos de cisteína ubicados en diferentes posiciones de los segmentos TM, para estudiar la dinámica de los mismos en membranas artificiales. Este procedimiento requiere de la purificación de las proteínas en estudio a homogeneidad. Hasta la escritura de esta tesis, los estudios in vitro de DesK completa requerían de la utilización de un sistema de expresión in vitro. Aunque el sistema libre de células ha demostrado ser adecuado para la expresión de DesK, el mismo es muy costosos para ser usado de forma rutinaria. Por este motivo, en una primera instancia nos enfocamos en desarrollar un protocolo que permitiese purificar DesK a partir de cultivos bacterianos, en concentración y pureza suficientes para estudios biofísicos posteriores a un costo reducido. Con este fin, ensayamos diversas estrategias para la expresión y purificación de DesK, incluyendo diferentes vectores de expresión, medios de cultivo, condiciones de crecimiento para la expresión proteica, detergentes para la solubilización de las proteínas de membrana y diversas técnicas cromatográfícas. En función de los resultados obtenidos planificamos un protocolo que permitirán purificar DesK a homogeneidad en micelas de detergente. Resultados posteriores mostraron que la integración de DesK en liposomas permite incrementar la pureza de la misma, indicando que sería posible realizar la marcación con la sonda de spin de las proteínas purificadas en detergente, y posteriormente reconstituir las mismas en liposomas para las subsiguientes mediciones por EPR. Por otra parte, a partir de un análisis informático de covariancia de residuos identificamos pares de aminoácidos con alta probabilidad de interaccionar, ya sea por su cercanía en la estructura cuaternaria, o a través del esqueleto peptídico de DesK. En función a estos resultados seleccionamos posiciones de los segmentos TM que próximamente se reemplazarán por cisteínas, generando variantes de DesK con mutaciones puntuales, para su posterior marcación con la sonda de spin y mediciones de EPR. Estos experimentos ermitirían obtener información estructural y dinámica de los segmentos TM durante la detección de la señal de temperatura. En base a predicciones de estructura secundaria junto con el análisis de las estructuras cristalográficas de la porción catalítica soluble de DesK (DesKC) en distintos estados funcionales, identificamos un motivo de hélices enrolladas (2-HCC) que conecta el dominio TM sensor y el dominio catalítico soluble. La construcción de dos variantes de DesK en las cuales se estabilizó (DesKSTA) o desestabilizó (DesKDEST) el dominio 2-HCC mediante mutaciones puntuales permitió determinar que este motivo juega un rol importante en la regulación de las actividades catalíticas de DesK. Además, de acuerdo con medidas de actividad in vitro de DesK salvaje y DesKSTA insertadas en liposomas, y a ensayos de dinámica molecular de modelos atómicos de DesK salvaje, DesKDEST y DesKSTA, se propuso que en el estado fosfatasa las hélices del segmento TM5 podrían continuar formando un 2-HCC a través de toda la membrana, y que la hidratación de este motivo podría favorecer la apertura del mismo durante la transición al estado auto-quinasa. Por otra parte, se construyeron modelos del estado fosfatasa y auto-quinasa de una quimera funcional de DesK (MS-DesK), la cual posee un único segmento TM por monómero, generado por la fusión de los 17 residuos N-terminales de DesK a los 14 residuos C-terminales del TM5 de DesK. En función a ensayos de dinámica molecular de estos modelos embebidos en bicapas lipídicas de diferente espesor, se propuso un modelo para la detección y transmisión de la señal de temperatura por parte de MS-DesK. En este modelo, a 37 ºC la membrana se encuentra fluida y delgada, y MS-DesK adopta una conformación fosfatasa competente, caracterizada por el enrollamiento de las hélices TM formando un 2-HCC que se prolonga hacia el dominio citoplasmático. Los residuos polares del extremo N-terminal de los segmentos TM se encuentran hidratados debido a la apertura del 2-HCC generada por la bisagra formada entre Gly13 y Pro16, y los dominios de unión a ATP (ABDs) interaccionan fuertemente con el dominio de dimerización y fosforilación de histidina (DHp). Frente a una disminución de la temperatura, la membrana pierde fluidez y se ensancha, generando un movimiento de tijera en el N-terminal de los segmentos TM, favoreciendo la deshidratación de los residuos polares. Los segmentos TM sufren un estiramiento debido al cierre del extremo N-terminal y al segmento citoplasmático KERER que permanece anclado en la interface lípido-agua citoplasmática. Este estiramiento promueve la rotación de las hélices que a su vez provoca el desenrollamiento de los segmentos TM y del 2-HCC. El desenrollamiento estaría favorecido por la hidratación de los residuos polares que se orientan hacia el núcleo del CC. Esta rotación se transmite al DHp, que ahora esconde los residuos hidrofóbicos que le permitían interaccionar con los ABDs. Finalmente, los ABDs quedan libres favoreciendo el estado auto-quinasa competente.Item Corrigendum: Identification of novel thermosensors in gram-positive pathogens(2022-08-31) Fernández, Pilar; Díaz, Alejandra Raquel; Ré, María Florencia; Porrini, Lucía; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela; Mansilla, María CeciliaItem Determinación del mecanismo de acción de los endocannabinoides en Caenorhabditis elegans(2023) Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Binolfi, AndrésEl colesterol es un lípido esencial constituyente de las membranas de las células eucariotas. Su función principal es estructural pero también lleva a cabo funciones como molécula de señalización. Por ello, la regulación del metabolismo colesterol es crucial para el normal funcionamiento de las células. En el nematodo Caernohabditis elegans (C. elegans), existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. En los últimos años, se ha propuesto que un conjunto de lípidos denominados N-aciletanolaminas (NAEs), antagonizan la detención del desarrollo de los nematodos [1]. Más recientemente, nuestro grupo de laboratorio demostró que otra clase de lípidos, los endocannabinoides (eCBs), regulan el ciclo de vida de C. elegans mediante la promoción de la movilización de colesterol [2]. Sin embargo, el mecanismo y las vías de señalización activadas por los eCBs para movilizar colesterol no son conocidas. Adicionalmente, numerosos trabajos sugieren un rol directo de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas [3] y cardiovasculares [4], sugiriendo que algunos ácidos grasos (AGs) regulan el desarrollo de diversas enfermedades. A pesar de que se ha avanzado mucho en el entendimiento del rol que juegan los lípidos para el mantenimiento de la homeostasis celular, su funcionalidad como moléculas de señalización esta superficialmente estudiada. Por este motivo, en este trabajo de tesis tratamos de elucidar como los eCBs actúan como moléculas de señalización promoviendo el transporte del colesterol en C. elegans. Pudimos identificar diferentes proteínas involucradas en la vía de señalización activada por 2-O-araquidonoil glicerol (2-AG), eCB derivado de ácido araquidónico (20:4 ω-6) [5], que estimula el transporte de colesterol. Nuestros experimentos sugieren que el 2-AG estimula la movilización de colesterol por un mecanismo dependiente de los receptores del tipo TRPV (de sus siglas en inglés: Transient Receptor Potential Vainoillid), la liberación de vesículas de núcleo denso como también de la vía de señalización de la insulina Por otra parte, desarrollamos metodologías de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) como metodología para el estudio del metabolismo de AGs in vivo en C. elegans. Este procedimiento nos permitió estudiar cómo se modifican los AGs y otros metabolitos en diferentes cepas mutantes y así identificar nuevos componentes involucrados en la vía de señalización desencadenada por el ortólogo a los receptores de adiponectina (AdipoR1 y AdipoR2), PAQR-2, en condiciones de baja temperatura [6–8]. Estos descubrimientos demuestran, por un lado, de forma precisa que vías de señalización son activadas por 2-AG en la regulación del tráfico de colesterol y, por el otro, aportan, claridad para el estudio del rol de los AGs como moléculas de señalización.Item Endocannabinoides derivados de ácido araquidónico son esenciales para la movilización de colesterol en el nematodo Caenorhabditis elegans(2020) Prez, Gastón; De Mendoza, Diego; Galles, CelinaLa correcta homeostasis de colesterol es crucial para el normal funcionamiento celular. Asimismo, el transporte de este esterol es sumamente importante para garantizar un equilirbio metabólico adecuado. En el nematodo Caernohabditis elegans, existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. La ausencia de estas hormonas produce un arresto larval o estadio de supervivencia denominado dauer. Por lo tanto, el correcto transporte de colesterol a los sitios de síntesis de estos ADs garantiza el desarrollo reproductivo de los nematodos. Recientemente, se ha descripto que C. elegans posee una nueva clase de glicoesfingolípidos denominados PEGCs, los cuales serían necesarios para la movilización de colesterol desde las reservas internas. En esta tesis logramos identificar otro grupo de lípidos involucrados en este proceso. Hemos descripto como cepas de nematodos deficientes en la síntesis de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) se arrestan en estadio dauer debido a una deficiencia en el transporte de colesterol. Este efecto esta correlacionado con la insuficiencia de endocannabinoides derivados de los PUFAs. La suplementación con los endocannabinoides 2- araquidonoil glicerol (2-AG) y anandamida (AEA), ambos derivados de ácido araquidónico, logró rescatar el arresto en dauer causado por la depleción de PUFAs. Asimismo, estos endocannabinoides son capaces de evitar el arresto dauer en gusanos mutantes en las proteínas transportadoras de colesterol NCR-1 y NCR-2. Las mismas son ortólogas a la proteína NPC-1 en humanos, la cual existe con pérdida de función en personas con síndrome Niemann-Pick. Por último, demostramos que los endocannabinoides 2-AG y AEA actúan a través de una vía paralela a la que actúan los PEGCs. Estos descubrimientos revelan una nueva función para los endocannabinoides, involucrándolos en la regulación del tráfico de colesterol.Item Endocannabinoids in Caenorhabditis elegans are essential for the mobilization of cholesterol from internal reserves(Nature, 2018-04-23) Galles, Celina; Prez, Gastón; Penkov, Sider; Boland, Sebastian; Porta, Exequiel Oscar Jesús; Altabe, Silvia Graciela; Labadie, Guillermo Roberto; Schmidt, Ulrike; Knölker, Hans-Joachim; Kurzchalia, Teymuras V.; De Mendoza, DiegoItem Estudio del Mecanismo de termodetección de DesK, una histidina quinasa termosensora de Bacillus subtilis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-10-24) Inda, María Eugenia; Cybulski, Larisa Estefanía; De Mendoza, DiegoEl cambio en la temperatura ambiental afecta a las reacciones biológicas y las células deben adaptarse. Un ejemplo de ello es la regulación de la fluidez de la membrana. Las bacterias pueden remodelar la fluidez de la bicapa con precisión a través de la incorporación de una mayor proporción de ácidos grasos insaturados cuando la temperatura de crecimiento disminuye, esto altera el ordenamiento de la bicapa lipídica y optimiza la fluidez. Pero, ¿cómo pueden las células "sensar" la fluidez de la membrana? La histidina quinasa DesK de Bacillus subtilis es el ejemplo paradigmático de un sensor térmico capaz de remodelar la fluidez de la membrana cuando la temperatura cae por debajo de 30 ° C, proporcionando un sistema para investigar el mecanismo de adaptación térmica. Entonces, ¿cuál es el mecanismo por el cual DesK es capaz de detectar cambios de temperatura y cómo puede convertir esta señal física externa en una respuesta biológica interna? Esta tesis estudia cómo la información térmica se integra, procesa y transduce para controlar la expresión génica y la intrigante posibilidad de que las deformaciones inducidas por la temperatura en la membrana celular actúen como reguladoras alostéricas. Como responsable del control por temperatura, encontramos una inestabilidad incorporada al sistema causada por un grupo de residuos hidrofílicos situados cerca del extremo N-terminal del primer segmento transmembrana, presumiblemente justo debajo de la interfase lípido/agua. Estos residuos enterrados en la fase lipídica a baja temperatura son capaces de bucear a la fase acuosa, estabilizando la posición del segmento transmembrana como una boya. En el extremo C-terminal de la parte transmembrana se detectó otro motivo sensible a la temperatura: el Cierre de Serina. El grosor de la membrana controla el estado de señalización del sensor al dictar el nivel de hidratación de este motivo hidrofílico metaestable. Nuestros resultados revelaron que DesK funciona como un dímero, en el que el motivo boya N-terminal actúa junto con un motivo hidrófilo C-terminal para causar una reorientación de las hélices en respuesta a cambios en el espesor de la membrana, dirigiendo la activación proteica. Sin embargo, la pregunta subyacente aún se mantiene: ¿Cómo puede la información detectada por la región transmembrana convertirse en un reordenamiento en el dominio catalítico citoplasmático para controlar la actividad de DesK? Aquí, identificamos una "región linker" implicada en la transmisión de la señal que conecta el transmembrana con el dominio citoplasmático. El linker adopta dos estados conformacionales en respuesta a los cambios de espesor de la membrana dependientes de la temperatura: (i) random coil, unido a las cabezas de los fosfolípidos, promoviendo el estado de la fosfatasa o (ii) no unido, formando una hélice continua que atraviesa la región de la membrana hasta el citoplasma, promoviendo así el estado quinasa. Nuestros resultados sostienen la idea de que el linker está dotado de una dualidad conformacional hélice/random coil que permite que se comporte como un interruptor de transmisión, con una discontinuidad en la hélice disminuyendo la relación de actividad quinasa/fosfatasa, como se requiere para modular la respuesta de DesK.Item Identification of Novel Thermosensors in Gram-Positive Pathogens(Frontiers Media, 2020-11-26) Fernández, Pilar; Díaz, Alejandra Raquel; Ré, María Florencia; Porrini, Lucía; De Mendoza, Diego; Albanesi, Daniela; Mansilla, María CeciliaItem Interhelical h-bonds modulate the activity of a polytopic transmembrane kinase(MDPI, 2021) Almada, Juan Cruz; Bortolotti, Ana; Ruysschaert, Jane Marie; De Mendoza, Diego; Cybulski, Larisa EstefaníaItem Regulación de la síntesis de lípidos en Bacillus subtilis durante la adaptación a bajas temperaturas de crecimiento(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2001) Aguilar, Pablo.; De Mendoza, DiegoEn este trabajo de Tesis se ha identificado y caracterizado un conjunto de genes que pertenece a un circuito regulatorio involucrado en la percepción y respuesta al frío en la bacteria Gram positiva B. subtilis. Para comenzar a elucidar las bases moleculares de la percepción de la temperatura en bacterias se identificó el gen que codifica para la actividad desaturasa frío inducible de B. subtilis. El estudio de este gen, denominado des, reveló que es monocistrónico y que B. subtilis posee una única actividad desaturasa, del tipo A5 acil lípido desaturasa. Se determinó que la expresión de des se encuentra estrictamente regulada por la temperatura de crecimiento. A 37ºC su transcripción se encuentra reprimida mientras que al descender la temperatura ambiente se induce su transcripción de manera transitoria. A diferencia de la mayoría de los genes descriptos como frío-inducibles en bacterias, el gen des no es regulado a través de la estabilidad de su ARNm. La regulación del gen des por temperatura es de carácter exclusivamente transcripcional. En la búsqueda de genes involucrados en la regulación del gen des, se identificó un operón, denominado desKR, cuyo dos genes, desKR y desR, resultaron ser esenciales para la inducción por frío del gen des. Este operón codifica para proteínas con homología a las de los sistemas reguladores de dos componentes. DesR, es una proteína soluble que se une específicamente al promotor del gen des. Desk presenta homología con histidin quinasas de membrana y la evidencia experimental recogida permite postular que presenta actividades fosfatasa y quinasa sobre DesR en función de la temperatura ambiente. Finalmente, se determinó que los AGIs constituyen una señal negativa en la inducción por frío del gen des. Por lo tanto un circuito regulatorio formado por las proteínas DesK y DesR y los AGIs constituye un nuevo mecanismo de control de la expresión génica a bajas temperaturas.Item Synthesis of a deuterated standard for the quantification of 2-Arachidonoylglycerol in Caenorhabditis elegans(JoVE, 2019-09-21) Fernández de Luco, Julia; Prez, Gastón; Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Labadie, Guillermo RobertoItem Transmembrane prolines mediate signal sensing and decoding in Bacillus subtilis DesK histidine kinase(American Society for Microbiology, 2019-11-26) Fernández, Pilar; Porrini, Lucía; Albanesi, Daniela; Abriata, Luciano A.; Dal Peraro, Matteo; De Mendoza, Diego; Mansilla, María Cecilia