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Ítem Acceso Abierto A duo of Potassium-responsive Histidine Kinases govern the multicellular destiny of Bacillus subtilis(American Society for Microbiology, 2015-07-07) Grau, Roberto Ricardo; De Oña, Paula; Kunert, Maritta; Leñini, Cecilia; Gallegos Monterrosa, Ramses; Mhatre, Eisha; Vileta, Darío; Donato, Verónica; Hölscher, Theresa; Boland, Sebastian; Kuipers, Oscar P.; Kovács, Ákos T.; http://orcid.org/0000-0001-6430-7122; http://orcid.org/0000-0001-6784-2534Multicellular biofilm formation and surface motility are bacterial behaviors considered mutually exclusive. However, the basic decision to move over or stay attached to a surface is poorly understood. Here, we discover that in Bacillus subtilis, the key root biofilm-controlling transcription factor Spo0A~Pi (phosphorylated Spo0A) governs the flagellum-independent mechanism of social sliding motility. A Spo0A-deficient strain was totally unable to slide and colonize plant roots, evidencing the important role that sliding might play in natural settings. Microarray experiments plus subsequent genetic characterization showed that the machineries of sliding and biofilm formation share the same main components (i.e., surfactin, the hydrophobin BslA, exopolysaccharide, and de novo-formed fatty acids). Sliding proficiency was transduced by the Spo0A-phosphorelay histidine kinases KinB and KinC. We discovered that potassium, a previously known inhibitor of KinC-dependent biofilm formation, is the specific sliding-activating signal through a thus-far-unnoticed cytosolic domain of KinB, which resembles the selectivity filter sequence of potassium channels. The differential expression of the Spo0A~Pireporter abrB gene and the different levels of the constitutively active form of Spo0A, Sad67, in spo0A cells grown in optimized media that simultaneously stimulate motile and sessile behaviors uncover the spatiotemporal response of KinB and KinC to potassium and the gradual increase in Spo0A~Pi that orchestrates the sequential activation of sliding, followed by sessile biofilm formation and finally sporulation in the same population. Overall, these results provide insights into how multicellular behaviors formerly believed to be antagonistic are coordinately activated in benefit of the bacterium and its interaction with the host. IMPORTANCE Alternation between motile and sessile behaviors is central to bacterial adaptation, survival, and colonization. However, how is the collective decision to move over or stay attached to a surface controlled? Here, we use the model plantbeneficial bacterium Bacillus subtilis to answer this question. Remarkably, we discover that sessile biofilm formation and social sliding motility share the same structural components and the Spo0A regulatory network via sensor kinases, KinB and KinC. Potassium, an inhibitor of KinC-dependent biofilm formation, triggers sliding via a potassium-perceiving cytosolic domain of KinB that resembles the selectivity filter of potassium channels. The spatiotemporal response of these kinases to variable potassium levels and the gradual increase in Spo0A~Pi levels that orchestrates the activation of sliding before biofilm formation shed light on how multicellular behaviors formerly believed to be antagonistic work together to benefit the population fitness.Ítem Acceso Abierto Assessment of Chemosensory Response to Volatile Compounds in Healthy, Aged, and Neurodegenerative Caenorhabditis elegans Models(Bio-protocol L.L.C., 2023-05-05) Grau, Roberto Ricardo; Crespo, CiraA basic function of the nervous system is to confer the ability to detect external stimuli and generate appropriate behavioral and physiological responses. These can be modulated when parallel streams of information are provided to the nervous system and neural activity is appropriately altered. The nematode Caenorhabditis elegans utilizes a simple and well characterized neural circuit to mediate avoidance or attraction responses to stimuli, such as the volatile odorant octanol or diacetyl (DA), respectively. Aging and neurodegeneration constitute two important factors altering the ability to detect external signals and, therefore, changing behavior. Here, we present a modified protocol to assess avoidance or attraction responses to diverse stimuli in healthy individuals and Caenorhabditis elegans models associated with neurodegenerative diseases.Ítem Acceso Abierto Bacillus subtilis biofilm extends Caenorhabditis elegans longevity through downregulation of the insulin-like signalling pathway(Nature, 2017-01-30) Donato, Verónica; Rodríguez Ayala, Facundo; Cogliati, Sebastián; Bauman, Carlos; Costa, Juan Gabriel; Leñini, Cecilia; Grau, Roberto RicardoÍtem Acceso Abierto Caenorhabditis elegans como modelo de infecciones provocadas por el patógeno Clostridium perfringens y nuevas alternativas para su combate(2019) Cogliati, Sebastián; Grau, Roberto RicardoClostridium perfringens es una bacteria anaerobia, Gram-positiva, formadora de esporas, responsable de la producción de severas enfermedades histotóxicas y gastrointestinales en humanos y animales. Este microorganismo es capaz de producir una gran cantidad y variedad de toxinas, generando patologías como gangrena gaseosa asociadas principalmente a las toxinas perfringolisina O y fosfolipasa C, o diarreas asociadas a alimentos contaminados o al uso excesivo de antibióticos producidos por la enterotoxina de Clostridium perfringens denominada CPE. En la actualidad, los estudios de las infecciones y las enfermedades causadas por C. perfringens se realizan sobre algunos mamíferos y aves, siendo una práctica controversial y de compleja aplicación, debido a los altos costos y a las implicancias bioéticas. En este trabajo de tesis,propusimos, estudiamos y concluimos la potencialidad del nematodo Caenorhabditis elegans, como modelo animal para el estudio de infecciones clostridiales. Este nematodo posee múltiples ventajas como modelo de estudio de la interacción patógeno – hospedador, es económico, transparente, posee el genoma completamente secuenciado, de vida corta. Debido a que la primera etapa en un proceso infectivo es la colonización del tejido diana, en una primera parte de este trabajo, estudiamos y determinamos que el patógeno es capaz de colonizar el intestino de C. elegans, es decir, establecerse, multiplicarse y esporular, y que produce sus toxinas letales extracelulares en el lumen intestinal. Además, a través de estudios de comportamiento, como quimiotaxis o movilidad, y por microscopia, observamos que el patógeno fue capaz de enfermar y dañar al nematodo, y que, a mayores tiempos de exposición del mismo al patógeno, los síntomas aumentaron, hasta ocasionarle la muerte. Se determinó, por ensayos de supervivencia, que C. perfringens, es capaz de matar al gusano por dos mecanismos diferentes, una muerte rápida, mediada por las toxinas extracelulares liberadas al medio ambiente (tasa de muerte de un 60%); y una muerte lenta, mediada por un proceso de colonización y establecimiento del patógeno en el hospedador (tasa de muerte del 30%). Sorprendentemente, no encontramos diferencias significativas en la supervivencia media de los gusanos infectados por la cepa 13 o la cepa SM101 utilizadas regularmente para el estudio de la gangrena gaseosa o de intoxicaciones por CPE, respectivamente. Luego, estudiamos los mecanismos moleculares de la inmunidad innata de C. elegans necesarios para la protección y defensa contra C. perfringens. Determinamos, que la vía de señalización de insulina/IGF-1 (IIS), mediada por el receptor DAF-2 o IGFR ortólogo en mamíferos, y la vía de señalización activada por la proteína DBL-1, ligando ortólogo en mamíferos al factor de crecimiento transformante β, son necesarias para la defensa innata contra el patógeno en estudio. Observamos, que un factor de transcripción, DAF-16 o FOXO en mamíferos, que induce la transcripción de genes antimicrobianos, fundamental para la supervivencia en presencia de C. perfringens, es regulado principalmente por DAF-2 y parcialmente por otras dos proteínas denominadas JNK-1 y RSKS-1 como parte de la defensa contra el mismo. El aporte de la vía DBL-1 en la inmunidad innata frente a este patógeno, resultó significativo, pero menor que la vía IIS. Interesantemente, tanto la vía DBL-1 como la vía IIS a través de DAF-16, comparten la regulación de algunas lisozimas microbicidas que se excretan al lumen intestinal, por lo que podrían estar relacionadas en ese punto para atacar y defenderse del patógeno. Por otro lado, uno de los factores de virulencia importante de C. perfringens, es que tiene la capacidad de esporular, por lo tanto, puede permanecer en estado latente hasta encontrarse con una herida abierta o ser ingerido, germinar, multiplicarse y producir la enfermedad. Por esto, y debido a la emergencia de patógenos multiresistentes a antibióticos, estudiamos la capacidad microbicida y esporicida de nuevas nanopartículas de cobre como alternativa a los microbicidas que se utilizan actualmente. Determinamos que estas nanopartículas de cobre sintetizadas por una vía innovadora son muy sensibles y eficaces contra las células vegetativas y las esporas de C. perfringens, y contra otros microorganismos patógenos y multiresistentes ensayados, por lo tanto, podrían ser una muy buena alternativa para reemplazar a los antimicrobianos y/o desinfectantes actuales. De este modo, la presente investigación muestra que es posible reemplazar y/o reducir el uso de mamíferos y aves en ensayos experimentales de patogenicidad de C. perfringes, indicando que, a través de los resultados obtenidos, el nematodo C. elegans se presenta como un modelo alternativo y eficiente para estudiar la influencia de los microrganismos patógenos en la salud.Ítem Acceso Abierto Desarrollo y mecanismos de acción de cepas bacterianas del género Bacillus como biocontroladoras (bioantifúngicos) de hongos fitopatógenos(2019) Bartolini, Marco; Grau, Roberto RicardoA. Capítulo 1: Aislamiento de cepas de Bacillus con actividad antifúngica. Las enfermedades y pestes constituyen un problema desde los comienzos de la agricultura. De las estrategias utilizadas para el control de plagas, los pesticidas sintéticos (―agroquímicos‖) son los compuestos más utilizados. El uso indiscriminado de estas sustancias químicas como controladores biológicos y los reportes cada vez más frecuentes de su potencial toxicidad para los usuarios y el medioambiente, condujeron al desarrollo de compuestos alternativos, ecológicos y naturales. En relación con esto, el uso de sustancias naturales y bacterias amigables con el ambiente con actividad insecticida y fungicidas (agentes biocontroladores) representan una alternativa interesante. En este trabajo de Tesis Doctoral, focalizamos nuestra atención en la caracterización de bacterias formadoras de esporas del género Bacillus aisladas de la región núcleo agronómico argentina. La capacidad de formar esporas hace de los Bacilli un tipo de bacteria biocontroladora atractiva para fines industriales debido a la alta estabilidad y longevidad de las esporas que, después de germinar, pueden generar los productos biocontroladores. En el transcurso de este trabajo de Tesis se aislaron 743 cepas de Bacillus provenientes de muestras de suelo, que fueron ensayadas contra diferentes hongos fitopatógenos de interés agronómico (cepas de Fusarium, Cercospora, Alternaria, Phomopsis, Mucor, Phomopsis, Penicillium, Rhizoctonia y Aspergillus). De estos 743 aislamientos, 75 de ellos presentaron una buena actividad antifúngica y 20 de ellos una excelente actividad biocontroladora de hongos. Debido a la importancia para la colonización de la rizósfera, se seleccionaron 9 de estas cepas por su habilidad de formar excelentes biofilms, su capacidad de colonizar la superficie y su compatibilidad con otras bacterias promotoras del crecimiento vegetal. Finalmente, se seleccionaron 4 aislamientos (denominados Mag2, Pur4, Teo22 y Ale22) en función de sus propiedades promotoras de crecimiento vegetal directas, colonización de la rizósfera y filósfera de la planta, y diversos efectos positivos indirectos sobre las semillas al germinar y durante los primeros estadios de crecimiento de la planta debido, principalmente, a la producción de compuestos volátiles con actividad biocontroladora. Mediante análisis filogenético por secuenciación del gen que codifica para el ARNr 16S, se determinó que las cepas seleccionadas pertenecían al grupo Bacillus subtilis / Bacillus amyloliquefaciens. Capítulo 2: Rol del factor transcripcional sigma B sobre la actividad antifúngica de Bacillus subtilis. Para responder a las diversas fluctuaciones e injurias del medio en el que se encuentra presente, B. subtilis induce la expresión del factor alternativo de la ARN polimerasa Sigma B, el cual dirige la expresión de un conjunto de genes, aproximadamente 200, que le permiten a la célula poner en marcha una serie de procesos destinados a sobrevivir bajo condiciones adversas. La pérdida de este factor (Sigma B) conduce a un incremento en la sensibilidad frente a diversos tipos de estrés metabólicos y ambientales. De este modo, la inducción de sigB y la de los genes que se encuentran bajo su control, el regulón Sigma B, le confieren a la bacteria una protección general, defensiva y/o preventiva frente a múltiples tipos de estrés (por ejemplo, la presencia de otros microorganismos, hongos, antagónicos). Muchas especies de Bacillus con actividad PGPR (Rizobacterias Promotoras de Crecimiento Vegetal) son capaces de producir potentes biofungicidas y estimular el sistema inmune de la planta cuando se enfrentan a un hongo fitopatógeno. Sin embargo, muy poco se sabe sobre la capacidad de las bacterias PGPR de reconocer al fitopatógeno y el proceso de respuesta. En este capítulo de la Tesis, mostramos cómo en el modelo B. subtilis, la interacción antagonista entre la bacteria y el fitopatógeno Fusarium verticillioides, representa una situación de estrés para la bacteria que conduce a la inducción del factor transcripcional SigB y su regulón sensible al estrés. El crecimiento dual entre F. verticilloides y diferentes cepas isogénicas de B. subtilis afectadas en la vía de activación de SigB, muestran que SigB fue activado y requerido para el biocontrol del hongo. Con respecto a la ruta de señalamiento, la ruta de activación de Sigma B dependiente de la energía, RsbP, fue la que estuvo a cargo de la detección del hongo. Por su parte, las otras dos rutas conocidas de activación de Sigma B, las rutas de detección de la temperatura y la dependiente del estrés medioambiental (RsbU), no participaron en la detección del hongo ni en la respuesta de la bacteria al mismo. La activación dependiente de hongo de SigB incrementa la expresión del operón responsable de la producción del lipopéptido cíclico surfactina (operón srf). Las células de B. subtilis deficientes de SigB producen significativamente menos cantidad de surfactina y los cultivos de B. subtilis mutantes en la producción de surfactina (∆srfAA) fueron completamente incapaces de controlar el crecimiento de F. verticillioides. Estos resultados proveen la primera evidencia de la participación del regulón de respuesta a estrés de un Bacillus PGPR y sus efectos contra los fitopatógenos nocivos en beneficio del desarrollo de la planta. Capítulo 3: Rol del factor transcripcional sigma B sobre la formación del biofilm de Bacillus subtilis. El desarrollo del biofilm representa un modo de vida ampliamente utilizado por muchos microorganismos y se considera la forma más frecuente de crecimiento de los mismos en la naturaleza. Las cepas de Bacillus subtilis son capaces de formar biofilm en la rizósfera de las plantas y desde allí producir efectos beneficiosos para la planta, incluyendo su protección contra enfermedades (por ejemplo, protección contra hongos fitopatogénicos). La formación del biofilm constituye para esta bacteria una estrategia alternativa de crecimiento y desarrollo la cual resultaría conveniente bajo ciertas condiciones. Mediante la utilización de fusiones reporteras transcripcionales lacZ dependientes de Sigma B y el empleo de fusiones transcripcionales del tipo PsigB-gfp, se pudo determinar que el gen sigB es expresado durante la formación del biofilm. La expresión del mismo fue transciente y tuvo lugar en etapas avanzadas del desarrollo del biofilm. La ruta energética dependiente de RsbP controla la activación de SigB durante el desarrollo del biofilm. La ausencia de actividad de Sigma B condujo a una notable disminución en la viabilidad de la población celular del biofilm, lo cual señala un nuevo e importante rol de esta proteína reguladora para el mantenimiento de la homeostasis dentro del biofilm maduro. Cepas mutantes en sigB son capaces de formar biofilms cuyas dimensiones son mayores a las que presentan los biofilms desarrollados por las cepas wt (silvestre), lo cual sugiere que Sigma B está participando en la regulación negativa del crecimiento y desarrollo del biofilm. Mediante mediciones de actividad β-galactosidasa de fusiones reporteras transcripcionales a diferentes promotores de interés, por su participación en el comportamiento multicelular de B. subtilis, descubrimos que en las cepas deficientes en la actividad de Sigma B, la expresión de sinR, que codifica para el regulador maestro (negativo) del desarrollo del biofilm, se encuentra notablemente disminuida. Debido al rol opuesto (positivo) que SinR ejerce sobre la motilidad, dependiente de flagelo (swarming y swiming) de B. subtilis se analizó qué ocurre con este fenómeno en cepas SigB y esto nos condujo a descubrir que Sigma B contribuye a regular, negativamente, los fenómenos de movilidad en B. subtilis. En base a estos resultados planteamos un modelo del desarrollo del biofilm en B. subtilis, que podría ser extendido a patógenos Gram-positivos que expresan ortólogos a Sigma B, donde se incorpora a Sigma B como un regulador clave en la elección del momento más adecuado entre dos estilos de vida diferentes: (i) quedarse en el lugar y no migrar formando estructuras comunitarias estables como los biofilms debido, por ejemplo, a las condiciones favorables encontradas ó (ii) escapar del lugar, migrar debido a que las condiciones actuales no son óptimas, tratando de encontrar y colonizar otros hábitats a través de inducción de la movilidad celular. Capítulo 4: Efecto del manganeso sobre la formación del biofilm y la esporulación de Bacillus subtilis. Las bacterias han evolucionado para adaptarse a diversos ambientes y responder a ciertas condiciones de estrés. La capacidad de sensar y responder efectivamente frente a estos factores ambientales involucra una variedad de sensores y reguladores específicos o globales. La modulación de los niveles de reguladores activos le permite a las bacterias responder a diversas señales a través de un único regulador central de la transcripción y activar o reprimir ciertas vías de diferenciación de manera espacio-temporal. Un modelo de estudio de estas respuestas es B. subtilis que, por ejemplo, en respuesta a la inanición, puede diferenciarse en subconjuntos, experimentando canibalismo, formación de biofilm o esporulación. Estos procesos están gobernados por un sistema de dos componentes expandido denominado ―phosphorelay‖, en el cual el regulador maestro Spo0A se activa tras su fosforilación mediada por una o una combinación de cinco histidin-quinasas sensoras (KinA-E) y a través de dos fosfotranferasas intermediarias llamadas, Spo0F y Spo0B. Cuatro de estas histidin-quinasas se dividen en tres grupos en función de los niveles de Spo0A-Pi cuya formación pueden catalizar. Las quinasas responsables de la formación de los mayores niveles de Spo0A-Pi son KinA-KinB induciendo la esporulación, los niveles más bajos de Spo0A-Pi son formados a través de KinB-KinC haciendo que las cepas de Bacillus activen la movilidad multicelular tipo sliding, mientras que la formación de una cantidad intermedia de Spo0A-Pi estimula la formación de biofilm vía KinC-KinD. KinD induce la formación de biofilm sensando moléculas liberadas por las plantas (por ejemplo polisacáridos) durante la colonización de la raíz. Sin embargo, sobre KinC, se conoce que para poder actuar necesita estar situada en microdominios de membranas formados por las proteínas FloA, FloT y los lípidos poli-isoprenoides sintetizados por YisP, y sólo está reportado el efecto inhibidor del potasio sobre la misma. Por tal motivo, en esta parte del trabajo de Tesis nos centramos, en la búsqueda de señales capaces de activar KinC para favorecer la formación del biofilm. Inicialmente, se trabajó con diferentes cepas domesticadas y no domesticadas (pobres y buenas formadoras de biofilms, respectivamente) con buena y poca capacidad de esporular, Pudimos comprobar que de los diferentes componentes (orgánicos e inorgánicos) de los medios de cultivo más comúnmente utilizados para favorecer la esporulación de B. subtilis, sólo el Mn+2 era capaz de estimular la esporulación a concentraciones no tóxicas, en el rango de 10 μM a 150 μM. Demostramos, mediante la utilización de fusiones reporteras del tipo abrB-lacZ, cuyas actividades dan una idea de los niveles de Spo0A-Pi formados, que el Mn+2 actúa como una señal activadora sobre la histidin-quinasa KinC. Este efecto del Mn+2 sobre KinC también estimula la formación del biofilm y se encuentra conservado en diferentes especies del género de Bacillus. Tanto para la esporulación como para la formación de biofilm, se demostró mediante el uso de diferentes construcciones genéticas in vivo que (i) el Mn+2 no ingresa por los transportadores que mantienen la homeostasis de este ión dentro de la célula, mntH y mntA, (ii) su efecto es independiente de la vía de la surfactina y el potasio y (iii) no necesita estar ubicado en los microdominios funcionales organizados de la membrana para activar a KinC. Utilizando construcciones que sobreexpresan los diferentes dominios de KinC, se encontró que el Mn+2 activa a la quinasa a través de la región de aminoácidos DEK que se ubica en la secuencia que une el segmento transmembrana de la quinasa con su región PAS-PAC. Por último, se encontró que el Mn+2 es capaz de activar la formación de biofilm, pero no la esporulación, sin necesidad del Phosphorelay; un hallazgo que podría permitirnos una mejor comprensión sobre los eventos tempranos de la interacción rizosférica beneficiosa de Bacillus con la planta. Los resultados de esta investigación son altamente novedosos ya que permiten una demostración fisiológica sobre cómo la bacteria podría decidir entre dos estados alternativos (biofilm y esporulación) regulados ambos positivamente por el mismo regulador (Spo0A), primero formaría el biofilm en la zona de la rizosfera a expensas de la estimulación (independiente del phosphorelay) de KinC en presencia de Mn+2 presente en el suelo solubilizado por los ácidos liberados por la raíz de la planta (por ejemplo ác. málico), y luego dentro de éste daría lugar a esporas, de manera dependiente de KinA y KinB (y del phosphorelay) en cuerpos fructíferos del mismo. Capítulo 5: Prueba al nivel de campo y escalado a planta piloto del proceso de producción de biofungicida. La comercialización de un producto a base de bacterias no sólo requiere del proceso de aislamiento, conservación y evaluación de estos microorganismos a nivel de laboratorio, sino que también requieren diseñar un proceso en donde se puedan producir grandes cantidades del principio activo conservando la mayor eficiencia de las propiedades observadas en el laboratorio. Otra parte importante para el desarrollo de estos productos, es que no sólo sea efectivo a nivel planta sino que también sea económicamente rentable su producción. En base a esto y como etapa final de la Tesis, los cuatro aislamientos obtenidos, en el capítulo 1, en función de la actividad PGPR y biofungicida, (Mag2, Pur4, Teo22 y Ale22) fueron utilizados para optimizar el escalado a nivel industrial de las cepas en fermentadores y la formulación de un probable producto comercial. Se estableció que las condiciones óptimas de crecimiento para estos bacilos en fermentadores de 10 litros son de 48 horas en modo batch con las siguientes condiciones: temperatura 37 °C, medio de cultivo SM calidad Standard con sales, agitación 200 rpm, volumen de inoculo 1/100 y el oxígeno disuelto se controló en 50 litros por minuto (LPM), volumen de trabajo de 80% de la capacidad de fermentación. Posteriormente al escalado, se desarrolló un formulado no toxico para el desarrollo de las bacterias ni para la actividad biocontroladora. Esta formulación está compuesta por un protector UV físico y uno químico, que le otorgan una supervivencia a las bacterias a campo cercana a 36 días de exposición solar. Además, estas bacterias fueron compatibles con los coadyuvantes comercializados por la empresa que son utilizados para la aplicación de los productos a campo. Como cierre del trabajo experimental, estas cepas formuladas se utilizaron para ensayos a campo obteniéndose mejores rendimientos y plántulas por metro cuadrado que los testigos. Estos estudios, en conjunto, permitirán el patentamiento, con propiedad intelectual de la UNR y CONICET, y registro de un producto por parte de Rizobacter S.A. (actualmente perteneciente al grupo Bioceres) en SENASA.Ítem Acceso Abierto Microbial flora, probiotics, Bacillus subtilis and the search for a long and healthy human longevity(Shared Science Publishers, 2017-03-16) Rodríguez Ayala, Facundo; Bauman, Carlos; Cogliati, Sebastián; Leñini, Cecilia; Bartolini, Marco; Grau, Roberto RicardoÍtem Acceso Abierto Probiotic properties of Bacillus subtilis DG101 isolated from the traditional Japanese fermented food nattō(Frontiers, 2023-09-28) Leñini, Cecilia; Rodríguez Ayala, Facundo; Goñi, Anibal Juan; Rateni, Liliana Beatriz; Grau, Roberto Ricardo; Nakamura, AkiraSpore-forming probiotic bacteria offer interesting properties as they have an intrinsic high stability, and when consumed, they are able to survive the adverse conditions encountered during the transit thorough the host gastrointestinal (GI) tract. A traditional healthy food, nattō, exists in Japan consisting of soy fermented by the spore-forming bacterium Bacillus subtilis natto. The consumption of nattō is linked to many beneficial health effects, including the prevention of high blood pressure, osteoporosis, and cardiovascular-associated disease. We hypothesize that the bacterium B. subtilis natto plays a key role in the beneficial effects of nattō for humans. Here, we present the isolation of B. subtilis DG101 from nattō and its characterization as a novel spore-forming probiotic strain for human consumption. B. subtilis DG101 was non-hemolytic and showed high tolerance to lysozyme, low pH, bile salts, and a strong adherence ability to extracellular matrix proteins (i.e., fibronectin and collagen), demonstrating its potential application for competitive exclusion of pathogens. B. subtilis DG101 forms robust liquid and solid biofilms and expresses several extracellular enzymes with activity against food diet-associated macromolecules (i.e., proteins, lipids, and polysaccharides) that would be important to improve food diet digestion by the host. B. subtilis DG101 was able to grow in the presence of toxic metals (i.e., chromium, cadmium, and arsenic) and decreased their bioavailability, a feature that points to this probiotic as an interesting agent for bioremediation in cases of food and water poisoning with metals. In addition, B. subtilis DG101 was sensitive to antibiotics commonly used to treat infections in medical settings, and at the same time, it showed a potent antimicrobial effect against pathogenic bacteria and fungi. In mammalians (i.e., rats), B. subtilis DG101 colonized the GI tract, and improved the lipid and protein serum homeostasis of animals fed on the base of a normal- or a deficient-diet regime (dietary restriction). In the animal model for longevity studies, Caenorhabditis elegans, B. subtilis DG101 significantly increased the animal lifespan and prevented its age-related behavioral decay. Overall, these results demonstrate that B. subtilis DG101 is the key component of nattō with interesting probiotic properties to improve and protect human health.Ítem Acceso Abierto Propiedades de multicelularidad de Bacillus subtilis y sus aplicaciones en el desarrollo de inoculantes para el agro(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-02-25) De Oña, Paula; Grau, Roberto RicardoPrimera Parte: La henificación, en sus distintas variantes, es la principal forma de conservar alfalfa pura o consociada. Existen dos formas principales de conservación del forraje: la henificación y el silaje. El primero actúa, principalmente, por deshidratación y el segundo por acidificación. La principal variable que se debe controlar en el proceso de henificar forraje, es la humedad. La reducción drástica de la humedad resulta clave una vez que el forraje ha sido cortado y conduce a la conservación de una mayor proporción del valor nutritivo original al conservar más hojas que tallos en el heno, reduciendo así la proliferación de diversos microorganismos contaminantes principalmente hongos indeseados. Para llevar a cabo esta primer etapa del trabajo, de índole aplicada, se realizó un aislamiento de cepas de Bacillus con alta capacidad esporulante, provenientes de distintas fuentes naturales como ser muestras henos de diferentes calidades y tierras de regiones cultivadas de la zona pampeana de nuestro país. De aquí se obtuvieron aproximadamente una 500 cepas del género Bacillus, las cuales fueron estudiadas en sus capacidades para controlar el crecimiento de distintas cepas fúngicas contaminantes típicos de henos y que producen grandes pérdidas de calidad de los forrajes, lo que se traduce en pérdidas económicas para el productor animal. Esto se ve reflejado luego en una disminución de la calidad de la carne y una menor producción de leche. Las cepas fúngicas que más interesaron controlar fueron Fusarium verticilloides, Aspergillus flavus, Mucor sp y Penicillium sp. Otro parámetro que se estudió para realizar una selección tentativa de las cepas que constituirán un futuro producto comercial fue su capacidad de deshidratar alfalfa. Para ello desarrollamos ensayos novedosos de deshidratación de alfalfa, que en conjunto con los ensayos de actividad antifúngica, permitieron seleccionar cuatro cepas salvajes de Bacillus. Estas cepas, se estudiaron en cuanto a su capacidad de desplazarse en medios semi-sólidos, el cual es un parámetro asociado a la capacidad de colonizar diversos nichos, que en nuestro caso sería la superficie de las hojas de alfalfa, su capacidad de esporular, el cual es un factor clave al momento de la producción industrial y por último su capacidad de formar biofilms, la cual está asociada a la producción de sustancias bio-activas. Además, se estudió la capacidad de las esporas de las cepas de Bacillus seleccionadas para llevar a cabo un ciclo de vida completo sobre el tejido vegetal: germinacióncrecimiento vegetativo-esporulación-germinación. Finalmente, las cepas seleccionadas fueron escaladas a nivel piloto en fermentadores, secuenciadas para conocer su identidad de especie exacta. Estos estudios, en conjunto, ermitirán el patentamiento, con propiedad intelectual de la UNR y el CONICET, y la formulación y registro del producto comercial por parte de BIOTAY S.A. en el SENASA. Segunda Parte: Diversas cepas de Bacillus han sido usadas como organismo modelo para el estudio en el laboratorio de numerosos aspectos biológicos y fisiológicos como ser división celular, competencia genética, formación de la espora y producción antimicrobianos. Estos estudios han considerado al bacilo como entidad individual, siendo tratados como organismos aislados y separados de su entorno. Sin embargo, en los últimos años ha resultado de fundamental interés el estudio de las bacterias como organismos de comportamiento multicelular ya que, paradójicamente, el mundo de las bacterias contiene numerosos ejemplos de este tipo de comportamiento comunitario, tales como la formación de biofilms, la formación de cuerpos fructíferos y el desplazamiento cooperativo sobre superficies. En ambientes naturales, el cooperativismo entre las células le brindaría a la población bacteriana una ventaja adaptativa muy importante. En este trabajo de Tesis, en una segunda instancia, nos hemos abocado al estudio y caracterización de uno de los comportamientos sociales de movimiento sobre superficies menos estudiados y por ende muy poco comprendido que son capaces de llevar a cabo ciertas bacterias en ambientes tanto naturales como en el laboratorio. Este tipo de movimiento es el sliding o deslizamiento, un tipo de deslizamiento independiente del flagelo. Para llevar a cabo estos estudios escogimos a Bacillus subtilis, bacilo Gram-positivo formador de esporas, como modelo de estudio. Empleamos dos cepas de Bacillus, una fue la cepa salvaje NCIB3610 relacionada con la cepa Marburg, la cual está reportada como capaz de desplazarse por medio de sliding y de swarming. El sliding es definido como una translocación “pasiva” sobre la superficie que sería impulsada por el crecimiento cooperativo de las células y facilitada por la producción de surfactante. Mientras tanto, el swarming se define como un movimiento multicelular activo y coordinando de las bacterias a través de las superficies accionado por los flagelos. La otra cepa escogida fue la cepa salvaje de origen japonés Bacillus subtillis natto (RG4365), la cual es utilizada para la preparación de una comida funcional probiótica típica nipona. Esta última cepa es totalmente inmóvil en medio líquido pero, por lo demostrado en este trabajo de Tesis, es capaz de desplazarse en medio semisólido. En una primera instancia se determinó la razón por la cual una de tales cepas era móvil en medio líquido y la otra cepa no. Se sospechaba que la cepa RG4365, no oseía flagelo. Por lo tanto se procedió, como una primera instancia evaluativa, a realizar un ensayo de tinción de flagelos a partir de células incubadas tanto en medio semi-sólidos como en medio de cultivo líquido. Este ensayo reveló que la cepa RG4365 no los poseía, mientras que la cepa NCIB3610 sí, por lo tanto se pudo determinar, en principio, que el movimiento que presenta la cepa nipona en medio semi-sólido sería del tipo sliding. Al medir la velocidad del desplazamiento sobre superficies de ambas cepas se encontró que la cepa RG4365 se movía aunque más lentamente que la cepa NCIB3610. A continuación y para confirmar nuestra presunción, se inactivó el gen hag, el cual codifica la subunidad de la flagelina en B. subtilis. Se pudo observar que ambas cepas se movían en el medio semi sólido, pero no en medio líquido, mediante sliding y a la misma velocidad. Un análisis posterior de los posibles reguladores del sliding demostró que el regulador maestro de la transcripción Spo0A era el responsable del sliding en ambas cepas salvajes. Spo0A, es el responsable de muchos de los comportamientos sociales o de adaptación de B. subtillis como ser el gatillado de la esporulación, la síntesis de ácidos grasos durante la diferenciación celular, la formación de biofilm pero no así del swarming. Se determinó mediante distintas construcciones génicas que los genes relacionados con el inicio de la esporulación no estaban implicados en el deslizamiento mientras que, AbrB, un represor de la formación de biofilm y de la expresión de genes relacionados con la adaptación a la fase estacionaria, estaba implicado parcialmente junto con Spo0A en la regulación del sliding, ambos como represores y activadores, respectivamente. Para profundizar nuestro estudio se realizó un análisis de transcriptómica donde se evaluaron los genes que se expresaron en distintas condiciones de incubación de tanto cepas salvajes como de mutantes en spo0A, en condiciones permisivas y no permisivas para el desplazamiento (sliding). Este estudio reveló que en condiciones permisivas de sliding se activaban genes relacionados con la formación de biofilm como por ejemplo tasA, epsG, bslA. También se determinó que el lipopéptido urfactina era un componente indispensable para el sliding. Además, se sobre-expresaban genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos (AG) como ser fabF, fabHBA, fabG, no así genes relacionados con la degradación de AG, sugiriendo que se requeriría para el sliding de la síntesis de AG de novo. Mediante un análisis del perfil de AG que se realizó en distintas condiciones permisivas y no permisivas de sliding se pudo determinar que la composición de la membrana lipídica del bacilo varía pese a que la temperatura permanecía constante. Se registró una disminución de la síntesis de AG lineales y aumentó el contenido de AG ante-iso de bajo punto de fusión, que le estaría brindando a la membrana una mayor fluidez para que la célula, en ausencia de la fuerza propulsora del flagelo, pudiese desplazarse de manera comunitaria a través de superficies a 37 °C, temperatura en la cual la síntesis de AG insaturados se encuentra inhibida. Puesto que en este punto ya hemos podido determinar cuál es el regulador de respuesta responsable del deslizamiento y los genes necesarios para llevarlo a cabo, nos propusimos estudiar, si hubiese, la señal que gatillaba el movimiento. Como se mencionó en párrafos anteriores, Spo0A es el regulador de respuesta responsable del sliding, el cual es activo en su forma fosforilada (Spo0A-Pi). Este fosfato es adquirido por Spo0A a partir de una posta de fosfatos conocida como phosphorelay. El phosphorelay es un sistema de transducción de señales similar a un sistema de dos componentes pero expandido, el cual está compuesto por cinco quinasas ensoras (KinA-E). Se sabe que cualquiera de las cuatro quinasas KinA, KinB, KinC o KinD (hasta el momento no hay ningún fenotipo reportado para KinE) detectan iferentes señales ambientales, se autofosforilan a partir de ATP y luego transfieren ese grupo fosfato, en primer instancia a Spo0F, que a su vez pasa su grupo fosforilo a Spo0B, el cual transfiere el fosfato a Spo0A, volviéndola activa. Para llevar a cabo el estudio sobre cuál/es quinasa/s serían las responsables del deslizamiento, en primer lugar se evaluó la capacidad de deslizarse de las cepas mutantes en la síntesis de cada una de las quinasas y se encontró que dos de ellas estaban implicadas en el sliding, KinB y en menor grado KinC. Está reportado que las quinasas del phosphorelay se encuentran divididas en sus funciones en grupos de redundancia donde KinA y KinB son las principales quinasas asociadas a la esporulación, mientras que KinC y KinD son las principales responsables de la formación de biofilm. Ahora, en base a nuestros estudios se adiciona otra dupla o dúo regulador, KinB/KinC, sobre el comportamiento social del sliding. Recientemente se reportó que KinB a través de su segundo segmento transmembrana está asociado con los citocromos caa3 y bc, cumpliendo de esta manera, un rol en el sensado del estrés nutricional dentro de un biofilm maduro. Sin embargo, descartamos la hipótesis de que la función que cumple KinB en el sensado del estrés nutricional esté relacionada con el sliding puesto que a medida que la colonia se expande sobre el medio de cultivo fresco los requisitos nutricionales estarían satisfechos y no se lo podría equiparar con el estilo de vida de las células “compactadas y mayormente inmóviles” dentro de un biofilm en cuya parte más íntima escasearían los nutrientes y el oxígeno activando estas señales a KinB. Por otro lado, se conoce que el potasio (K+) cumple un rol inhibitorio sobre la actividad estimuladora de la formación del biofilm de KinC al interactuar con su dominio PAS-PAC. La surfactina producida durante la formación del biofilm actuaría como molécula quelante del potasio intracelular liberando, de esta manera la inhibición producida por el K+. Además, se sabe que la concentración intracelular del ion mencionado disminuye a medida que la célula alcanza la fase estacionaria. Otros estudios, analizaron las características de la formación de la colonia en un biofilm sólido de B. subtillis en medios definidos con y sin K+ y se encontró que en medios depletados del metal, las colonias (biofilms) se desarrollaron en forma de dendritas. En nuestros estudios, cuando se analizaron las características de las cepas mutantes en las quinasas se pudo apreciar, en principio como una curiosidad, que todas las mutantes en kinB formaban colonias estrelladas y con mayor predisposición a formar biofilm que la cepa salvaje. A posteriori demostramos la existencia de una estimulación del sliding dependiente de la concentración de K+ que no se presentaba en cepas deficientes en kinB. Estos resultados, nos indicaron la estimulación positiva que el potasio tiene sobre esta quinasa KinB. Con los resultados hasta aquí obtenidos, nos avocamos al estudio de la estructura de KinB y su posible relación con el potasio. Para esto, se analizaron las estructuras típicas de proteínas sensoras de potasio o que lo unen, en particular los canales de potasio presentes tanto en eucariotas como en procariotas. De este análisis surgió una posible región, que no poseen ninguna de las otras quinasas del phosphorelay, que se encuentra solapada con el sitio de unión a ATP de la quinasa KinB en la región citoplasmática, la cual posee una alta similitud con la secuencia de aminoácidos consenso de la región filtro o dominio selectivo de unión de potasio conservada en todos los canales de potasio conocidos a la fecha. A partir de este hallazgo, se realizaron diferentes mutaciones puntuales sobre el gen kinB en la región codificante para el supuesto sitio de reconocimiento de K+ que posee la quinasa KinB y se estudió su efecto sobre el sliding. Estas mutaciones deberían no afectar la capacidad de esporular, de manera de saber que la mutante en KinB es activa en esporulación, y poder evaluar qué ocurriría con la activación del sliding. Verificada esta hipótesis, es decir que los mutantes en KinB con el sitio de selectividad para potasio mutados, no activaban el sliding y eran totalmente inmóviles, pero sí esporulaban, pudimos proponer un nuevo rol de KinB, junto con KinC, como las quinasas reguladoras del movimiento social tipo sliding a través del sensado de la fluctuación de potasio intracelular en distintas regiones (centro y periferia) que se da durante la expansión (sliding) de la colonia. Nuestra hipótesis, avalada por resultados experimentales de índole genética y fisiológica no descriptos en este resumen, propone que existe una regulación espacio-temporal de las quinasas en una colonia en deslizamiento activo. En un principio, cuando la colonia está compuesta por unas pocas células, la concentración intracelular de potasio es alta y está siendo sensada por KinB, que además, es la quinasa que se expresa primero permitiendo la activación del sliding y la inhibición por potasio del biofilm dependiente de KinC. A medida que la colonia se va desarrollando, KinC se expresa a mayores niveles, pero sigue inhibida en la periferia de la colonia en expansión por la presencia del K+ pero ya no así en el centro de la colonia donde las células se encontrarían en fase logarítmica tardía y por ende las concentraciones de potasio disminuirían por la presencia de surfactina y tansportadores de K+ activos que expulsarían el catión al medio extracelular. Esto último libera a KinC de su inhibición e inicia la formación de biofilm en el centro de la comunidad bacteriana, dejando las células en expansión en los bordes de la colonia, con KinB siendo estimulada por potasio para seguir avanzando en búsqueda de nuevos nichos. A tiempos mayores de incubación, en el centro de la colonia, donde se formó el biofilm, los nutrientes comienzan a escasear, el estrés nutricional continúa aumentando hasta llegar a niveles de activación de KinA, lo cual permite la formación de cuerpos fructíferos donde finalmente las células esporulan. Los resultados de esta investigación son altamente novedosos ya que describen un mecanismo cooperativo de movilidad social, el sliding, presente no solo en Bacillus sino también en varios patógenos productores de enfermedades infecciosas relevantes (Tuberculosis, Lepra, Ántrax, etc). Hemos identificado los componentes estructurales (BslA, Fas, TasA, EPS) de la maquinaria del mismo, los genes reguladores implicados en el mismo (Spo0A Y AbrB) y su forma de regulación (phosphorelay) identificando los sensores (KinB Y KinC), la señal (potasio intracelular) y la manera en que funciona (regulación espacio-temporal a través de la unión al sitio de selectividad de KinB y la región PAS-PAC de KinC). Además nuestros resultados podrían tener una relevancia importante en la determinación del comportamiento de los Bacilli en la naturaleza, donde deben colonizar nuevos nichos desplazándose de un lugar a otro, por ejemplo en la zona de la rizósfera de las plantas. Relacionado a esto, es de amplio conocimiento el uso de B. subtilis como agente de biocontrol a través de la producción de sustancias bio-activas y su reconocido uso en la agroindustria como inoculante o promotor del crecimiento vegetal. Precisamente, el desarrollo de esta beca Doctoral se llevó a cabo en el marco de un proyecto co-financiado con la empresa BIOTAY S.A. a través de un convenio de transferencia tecnológica tipo PID, entre la UNR, la empresa BIOTAY S.A., el FONCyT y el Conicet, donde el objetivo es desarrollar un producto comercial de base biotecnológica formulado con cepas del género Bacillus autóctonas para el mejoramiento de forrajes conservados (henos) destinados a la alimentación animal.Ítem Acceso Abierto Regulación catabólica por carbono de los factores de patogenicidad de Clostridium perfringens relacionados con la gangrena gaseosa(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-04-04) Méndez, Marcelo Bernabé; Grau, Roberto RicardoClostridium perfringens es una bacteria anaeróbica, Gram-positiva, formadora de esporas, responsable de la producción de severas enfermedades histotóxicas y gastrointestinales en humanos y animales. C. perfringens es capaz de producir varias toxinas, dos de las cuales son las principales implicadas en la patología conocida como gangrena gaseosa. Debido a que esta bacteria posee un metabolismo sacarolítico-fermentativo y porque la regulación catabólica por carbono está implicada en el control de diferentes comportamientos bacterianos, este trabajo investigó los efectos de la glucosa y otros carbohidratos rápidamente metabolizables sobre la movilidad tipo gliding y la producción de las toxinas fosfolipasa C (PLC) y la perfringolisina O (PFO), fundamentales para el dasarrollo de la gangrena gaseosa. Los resultados obtenidos demuestran que la regulación catabólica por carbono constituye un importante mecanismo regulatorio fisiológico que reduce la capacidad de movilizarse por gliding de la cepa de C. perfringens causante de la gangrena gaseosa (Cepa 13), asi como de un gran número de aislados patogénicos de esta bacteria derivados de humanos y animales. La inhibición del gliding en presencia de glucosa fue debida, al menos en parte, a la represión de genes involucrados en la biosíntesis y funcionalidad del pili tipo IV (T4P), el cual es requerido para la movilidad tipo gliding. El efecto inhibitorio de la glucosa sobre los genes del T4P pilT y pilD se encuentra bajo el control de la proteína regulatoria CcpA (catabolite control protein A). La deficiencia en CcpA en la cepa de C. perfringens mutante en ccpA restaura la expresión de pilT y pilD en presencia de concentraciones represivas de glucosa. La expresión de PLC y PFO en cultivos de la cepa productora de la gangrena gaseosa, Cepa 13, también es reprimida catabólicamente por carbono. La glucosa produce una fuerte inhibición dosis-dependiente del gliding y una reducción de más del 50 % en la producción de las histotoxinas PLC y PFO sin afectar el crecimiento vegetativo del patógeno. La represión de los genes plc y pfoA dependió también de CcpA, ya que una cepa deficiente en este regulador no presenta inhibición de la expresión de PLC en presencia de glucosa 2 %. Además, se observaron dos fenómenos novedosos, por un lado se descubrió que CcpA tiene un rol positivo en la expresión de pilT, pilD y la capacidad de moverse por gliding en ausencia de regulación catabólica. El otro fenómeno fue el efecto negativo que ejerce CcpA sobre la producción de toxinas, debido a que en la cepa deficiente en CcpA, PLC y PFO se expresan en un nivel superior al observado en la cepa salvaje en ausencia de regulación catabólica. CcpA actuaría, de acuerdo a las condiciones experimentales y fisiológicas de la célula, como un regulador positivo y negativo (en ausencia y presencia de catabolitos, respectivamente) del gliding, siendo un represor de la producción de toxinas en condiciones de regulación catabólica por carbono.Ítem Acceso Abierto Surfing of bacterial droplets: Bacillus subtilis sliding revisited(National Academy of Sciences, 2017-10-17) Kovács, Ákos T.; Grau, Roberto Ricardo; Pollitt, Eric J. G.Hennes et al. (1) report on the collective slipping of Bacillus subtilis colonies across the agar surface, termed “colony surfing.” We read this article with great interest. However, we understand that specific points require a more detailed discussion. We would like to highlight complementary biological observations on this area previously published by us and others but omitted by Hennes et al. (1) with the aim of bringing about a common terminology that facilitates understanding between the biophysics and the microbiology communities. [...]Ítem Acceso Abierto The stress-responsive alternative sigma factor SigB of Bacillus subtilis and its relatives: an old friend with new functions(Frontiers Media, 2020-09-15) Rodríguez Ayala, Facundo; Bartolini, Marco; Grau, Roberto RicardoÍtem Acceso Abierto Transcriptional regulation of adhesive properties of Bacillus subtilis to extracellular matrix proteins through the fibronectin-binding protein YloA(John Wiley & Sons Ltd, 2017-03-27) Rodríguez Ayala, Facundo; Bauman, Carlos; Bartolini, Marco; Saball, Ester; Salvarrey, Marcela; Leñini, Cecilia; Cogliati, Sebastián; Strauch, Mark; Grau, Roberto Ricardo; http://orcid.org/0000-0002-6496-3696Bacterial adherence to extracellular matrix proteins (ECMp) plays important roles during host–pathogen interaction, however its genetic regulation remains poorly understood. yloA of the model bacterium Bacillus subtilis shows high homology to genes encoding fibronectin-binding proteins of Gram-positive pathogens. Here, we characterized the regulatory network of YloA-dependent adhesive properties of the probiotic B. subtilis natto (Bsn). YloA-proficient, but not YloA-deficient, Bsn specifically bound to ECMp in a concentration-dependent manner and were proficient in biofilm formation. yloA expression showed a continuous increase in activity during the growth phase and decreased during the stationary phase. The transcription factors AbrB and DegU downregulated yloA expression during the logarithmic and stationary growth phases respectively. Analysis of the yloA promoter region revealed the presence of AT-rich direct and inverted repeats previously reported to function as DegU-recognized binding sites. In spo0A cells, yloA expression was completely turned off because of upregulation of AbrB throughout growth. Accordingly, DNase I footprinting analysis confirmed that AbrB bound to the promoter region of yloA. Interestingly, Bsn bound fibronectin with higher affinity, lower Kd, than several bacterial pathogens and competitively excluded them from binding to immobilized-fibronectin, a finding that might be important for the anti-infective properties of B. subtilis and its relatives.Ítem Acceso Abierto Two cases of type 2 diabetes mellitus successfully treated with probiotics(Wiley, 2020-12-21) Cardinali, Néstor; Bauman, Carlos; Rodríguez Ayala, Facundo; Grau, Roberto Ricardo; https://orcid.org/0000-0002-6496-3696The gut microbiota, and particularly probiotic bacteria, has emerged as a promising and novel intervention to fight the looming worldwide diabetes epidemic when combined with the appropriate medication. Herein, we report two cases of patient with type 2 diabetes refractory to conventional therapy that showed notable improvement after probiotic intervention.