Examinando por Autor "Roma, Marcelo Gabriel"
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Ítem Acceso Abierto Adaptive downregulation of Cl- /HCO3 - exchange activity in rat hepatocytes under experimental obstructive cholestasis(Public Library of Science (PLOS), 2019-02-21) Miszczuk, Gisel Sabrina; Banales, Jesus M.; Zucchetti, Andrés E.; Pisani, Gerardo Bruno; Boaglio, Andrea C.; Saez, Elena; Medina, Juan F.; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.Ítem Acceso Abierto Alteraciones hepatocelulares inducidas por estrés oxidativo: bases moleculares y papel de las cascadas de señalización(2007) Pérez, Leonardo Martín; Roma, Marcelo Gabriel; Sánchez Pozzi, Enrique JuanNumerosas patologías hepáticas poseen un componente oxidativo como parte de su mecanismo de daño tisular. El estrés oxidativo eleva los niveles citosólicos de Ca2+ y puede, potencialmente, activar una serie de eventos de señalización induciendo cambios morfológicos y funcionales que conducen, en última instancia, a la muerte celular. La comprensión de estos procesos es de suma importancia, ya que puede promover el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas con capacidad para prevenir, o mejor aún, revertir los daños al tejido hepático inducidos por estrés oxidativo. En este trabajo de tesis, se demostró la participación de proteína quinasa C (PKC) dependiente de Ca2+ en la disfunción biliar, y en la desorganización del citoesqueleto de actina y de las uniones estrechas, inducidos por el pro-oxidante modelo tert-butil hidroperóxido (tBOOH), utilizando el modelo de duplas aisladas de hepatocitos de rata. tBOOH (100 μM, 15 min) elevó los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS), indicado por el aumento en la lipoperoxidación (+186%, p < 0,05) y la producción ROS-dependiente de 2´,7´-diclorofluoresceína (+36%, p < 0,05). A su vez, generó un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ (+100%, p < 0,05), y estimuló la translocación a membrana de la isoforma dependiente de Ca2+ de PKC PKCα como parámetro de su activación (+79%, p < 0,05). También, se observó una reducción en el número de duplas capaces de acumular y de retener (aprox. -50% en ambos parámetros, p < 0,05) en su vacuola canalicular el análogo fluorescente de sal biliar colil-lisil fluoresceína (CLF). Estos eventos se acompañaron de internalización de la bomba exportadora de sales biliares Bsep, redistribución de la proteína asociada a uniones estrechas ZO-1, desorganización de F-actina y formación de protrusiones de membrana (+285%, p < 0,01), este último un marcador precoz del daño estructural al citoesqueleto. Todos estos eventos fueron completamente prevenidos por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (20 μM), los inhibidores panespecíficos de PKC H7 (100 μM) y SP (10 μM), el inhibidor de isoformas de PKC dependientes de Ca2+ Gö6976 (2 μM) y el activador de PKA DB-AMPc (500 μM); PKA frecuentemente contrarregula los efectos de PKC. Por otro lado, una dosis mayor de tBOOH (500 μM, 15 min) indujo despolarización mitocondrial (aprox. +80%, p < 0,01), fenómeno asociado a la apertura de poros de transición de permeabilidad (PTPM), y aumento en la producción de ROS de origen mitocondrial (+1000% en los niveles de lipoperoxidación, p < 0,01). Estos eventos fueron prevenidos (aprox. –30%, p < 0,05) por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (50 μM), por los inhibidores de CaM W7 (100 μM) o trifluoperazina (TFP, 10 μM) y por el inhibidor de CaMKII KN-62 (10 μM); el nivel de prevención alcanzado fue similar al obtenido con el bloqueante de PTPM CsA (5 μM), indicando que la exacerbación del daño hepatocelular oxidativo, vía formación de PTPM, se encuentra mediada por la vía citosólica de señalización Ca2+-CaM-CaMKII. En conclusión, estos resultados indican que los ROS pueden ejercer efectos deletéreos en el hepatocito activando cascadas de transducción de señal, y no sólo actuando como efectores directos del daño oxidativo.Ítem Acceso Abierto Biología celular del proceso de internalización endocítica de transportadores hepatocelulares canaliculares en colestasis por estrógenos(no disponible, 2016-12-16) Miszczuk, Gisel Sabrina; Crocenzi, Fernando A.; Roma, Marcelo GabrielEl estradiol-β-D-glucuronido (E17G) es un metabolito endógeno del estradiol cuyos niveles plasmáticos aumentan durante el embarazo, habiendo sido postulado como responsable de la patogénesis de la colestasis intrahepática que ocurre en las mujeres susceptibles embarazadas. La administración de E17G a ratas hembras produce una colestasis dosis-dependiente, aguda y reversible, afectando las fracciones dependientes e independientes de sales biliares del flujo biliar. nuestro grupo demostró que la alteración secretora bibliar inducida por E17G en la rata es críticamente dependiente de la endocitosis de transportadores hepatocelulares canaliculares claves para la formación de bilis, como Bsep Mrp2. Asimismo demostramos que este fenómeno está mediado por la activación de varias vías de señalización intracelular, como aquellas dependientes de REα-cPKC-ERK1/2, PI3K-Akt-p38MAPK y GPR30-AC-PKA. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la endocitosis de los transportadores canaliculares es desconocido, y su esclarecimiento representa el objetivo principal de esta tesis. En una primera etapa, y ante la necesidad de contar con un modelo hepatocelular polarizado para el estudio de estos mecanismos, hemos validado el cultivo primario de hepatocitos de rata en sándwich de colágeno (CPHS) para el estudio de drogas que afectan la formación de bilis a través de la inducción de endocitosis de transportadores canaliculares. Tratando los CPHS con los agentes coléstasico E17G y taurolitocolato, así copmo con el compuesto colerético y anticolestásico DBAMPc, demostramos la utilidad de este modelo in vitro para detectar y cuantificar cambios en la secreción canalicular tanto de tipo colestásico como colerético, así como los cambios en la localización intracelular de transportadores canaliculares causales de dichas alteraciones funcionales. En la segunda etapa, el uso de inhibidores especificos de las vías endocíticas depenmdientes de clatrina y de caveolinas en duplas aisladas de hepoatocitos aportó evidencia preelimiar que E17G induce la endocitosis de Bsep y Mrp2 por un mecanismo dependiente de clatrina. Se obtuvo evidencia adicional de este mecanismo en hígados aislados y perfundidos, donde un inhibidor especifico de esta vía endocítica, monodansilcadaverina, previno la caída en el flujo biliar y la excreción biliar de sustrato de Bsep y Mrp2, así como la endocitosis de dichos transportadores evaluada por microscopía confocal. A modo confirmatorio de la dependencia de clatrina en la endocitosis de estos transportadore inducida por E17G, observamos que el bloque de esta vía mediante knock-down por RNA interferente de la expresión de AP2 (componente clave de la maquinaria endocítica dependiente de clatrina) en CPHS, llevó a una prevención completa de la función de transporte y de la endocitosis Bsep y Mrp2. En forma adicional, demostramos que E17G altera la localización de membrana de estos transportadores (originalmente enriquecidos en microdominois raft, ricos en colesterol y caveolina), llevando a un enriquecimiento de los mismos en microdominios canaliculares ricos en clatrina (no rafts), desde donde puede producirse la endocitosis dependiente de la misma. Por ultimo, como una primera aproximación a la identificación de los blancos celulares de aquellas proteínas quinasas activadas por E17G que conducen en última instancia a la endocitosis dependiente de clatrina de los transportadores canaliculares, se realizaron estudios de fosfoproteómica para identificar proteínas que modifiquen su grado de fosforilación frente al tratamiento con este estrógeno. Esto llevo a la identificación de numerosas proteínas que incrementan su fosforilación por E17G, dejando abierta así la posibilidad de realizar experimentos tendientes a evaluar su posible rol como intermediarios entre las vías de señalización pro-colestásicas y el proceso final de endocitosis de transportadores canaliculares conducente a la alteración colestásica.Ítem Acceso Abierto G-protein-coupled receptor 30/adenylyl cyclase/protein kinase A pathway is involved in estradiol 17ß-D-glucuronide-induced cholestasis(Wiley, 2014-10) Zucchetti, Andrés E.; Barosso, Ismael R.; Boaglio, Andrea C.; Basiglio, Cecilia Lorena; Miszczuk, Gisel Sabrina; Larocca, María Cecilia; Ruiz, María Laura; Davio, Carlos A.; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.; Sánchez Pozzi, Enrique JuanÍtem Acceso Abierto La inducción de la Hemoxigenasa 1 previene la falla secretora biliar inducida por estrés oxidativo en la rata(Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades del Hígado (AAEEH), 2017-06) Ceccatto, Paula; Martín, Pamela L.; Arriaga, Sandra Mónica María; Sánchez Pozzi, Enrique J.; Roma, Marcelo Gabriel; Basiglio, Cecilia Lorena; Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades del Hígado (AAEEH)Previamentedemostramos que concentraciones fisiológicas de bilirrubina previenen la fallasecretora biliar inducida por estrés oxidativo (EO) in vitro. En este trabajo evaluamosel efecto de la inducción de hemoxigenasa 1 (HO1) y el consecuenteaumento en los niveles endógenos de bilirrubina sobre la colestasis aguda inducidapor EO in vivo. Para ello, ratas Wistar macho adultas se trataron con hemina(5-20 mg/kg p.c.) y se determinaron las concentraciones de bilirrubina en bilis (mg/dl), encontrándose que la mismaaumentasignificativamente entre las 6 y las 8 h pos inyección para 20 mg/kg p.c. (12,6± 2,5 vs 5,3 ± 0,6 para el vehículo;p<0,001; n = 4). La injuria colestásica oxidativa se indujo utilizandoelagente pro-oxidante tert-butilhidroperóxido (tBuOOH, 220-880 µmol/kg p.c.) y se monitoreó el flujo biliar (µl/min/g hígado), encontrándose que el mismo disminuyesignificativamente entrelas 4 y las 6 h postratamiento a partir de 440µmol/kg p.c. (p<0,05 vs Control; n = 6). Posteriormente, se estudió el efecto de lainducción de HO1 sobre la colestasis por EO. El pretratamiento conhemina previno completamente la disminución del flujobiliar inducido por tBuOOH (1,65 ±0,04 y 1,30 ± 0,03; respectivamente; p<0,01; n = 6) y no difirió del Control (1,56 ± 0,01; p>0,05; n = 6). El estado redox se evaluómidiendo los niveles de lipoperoxidación, la relación de glutatión oxidado aglutatión total (GSSG/GSHt) y la actividad de las enzimas antioxidantescatalasa (CAT) y superóxido dismutasa (SOD). Encontramos que tBuOOH provocó un aumento de lalipoperoxidación (0,170 ± 0,022 UA vsControl 0,090 ± 0,005 UA; p<0,05; n= 6), mientras que el pre-tratamiento con hemina previno este incremento (0,082± 0,001 UA; p<0,05 vs tBuOOH; n = 6). La relación GSSG/GSHt aumentósignificativamente luego del tratamiento con tBuOOH (0,40 ± 0,09 vsControl 0,14 ± 0,12; p<0,05; n =6), mientras que el pretratamiento con hemina previno este aumento (0,20 ±0,01, p<0,05; n = 6). Tanto laactividad de CAT como la de SOD se encontraron aumentadas en el grupo tBuOOH (p<0,05 vs Control, n = 3, paraambas enzimas), mientras que el pretratamiento con hemina previno completamenteambos aumentos (p<0,05 vs tBuOOH, n = 3). Concluimos que la inducción de HO1 y la consecuenteelevación de bilirrubina protegen alhígado de la injuria oxidativa, previniendo la colestasis que se origina. Estocontribuiría a limitar la progresión de hepatopatías colestásicas que cursancon EOÍtem Acceso Abierto Induction of Hemoxygenase 1 prevents acute hepatic cholestasis produced by oxidative stress in the rat(Fundación Revista Medicina, 2017-11) Martín, Pamela L.; Ceccatto, Paula; Arriaga, Sandra Mónica María; Sánchez Pozzi, Enrique J.; Roma, Marcelo Gabriel; Basiglio, Cecilia Lorena; Sociedad Argentina de Investigación ClínicaHere,we studied the effect of HO1 induction andconsequent increase in endogenous levels of bilirubin (BR) on OS-induced cholestasis.Wistar rats were treated with Hemin (H)and biliary concentrations of BR were determined, finding that it increased 6-8h post i. p. injection of 20 mg/kg H (12.6±2.5 vs 5.3±0.6 for vehicle, p<0.001;n=4). Oxidative cholestatic injury was induced by tert-butyl hydroperoxide (tBOOH,440 μmol/kg, i.p.) and bile flow (μl/min/g liver) was monitored finding that it decreased 4-6h post treatment (p<0.05 vs control; n=6). Pretreatment with Hcompletely prevented reduction of bile flow (1.65±0.04 and 1.30±0.03, respectively; p<0.01;n=6). Redox state was evaluated by measuring levels of lipid peroxidation (LP), oxidized glutathione/total glutathione ratio (GSSG/GSHt) and activity of antioxidant enzymes catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD). We found that tBOOH caused an increase in LP (0.170±0.022nmol MDA/mg proteínvs C, 0.090±0.005nmol MDA/mg protein p<0.05;n=6) while pretreatment with H prevented this increase (0.082±0.001nmol MDA/mg protein 0.05 vstBOOH; n=6). GSSG/GSHt ratio increased after treatment with tBOOH (0.40±0.09 vs C, 0.14±0.12, p<0.05;n=6) while pretreatment with H prevented this increase (0.20±0.01, p<0.05;n=6). CAT and SOD activities were increased in tBOOH group (p<0.05 vs C, n=3, for both enzymes) while pre-treatment with H completely prevented these increases (p<0.05 vstBOOH,n=3). We also studied the function of two key hepatocanalicular transporters, Bsep and Mrp2, by determining biliary excretion of their specific substrates, bile salts (BS) and GSHt, respectively. Biliary excretion of both BS and GSHt decreased after treatment with tBOOH, and pretreatment with H prevented these decreases (p<0.05 vstBOOH, n=4).We conclude that induction of HO1 and consequent elevation of BR protect the liver from oxidative injury and contribute to limit the progression of cholestatic liver diseases concurring with OS.Ítem Acceso Abierto Mecanismos anticolestásicos de agentes terapéuticos de relevancia clínica en colestasis de tipo inflamatoria(2019) Razori, María Valeria; Roma, Marcelo Gabriel; Ruiz, María LauraEl lipopolisacárido (LPS) de la pared de las bacterias Gram negativas (endotoxina) induce colestasis inflamatoria al alterar la expresión, función y localización de los transportadores involucrados en la formación de bilis, por ejemplo, la bomba exportadora de sales biliares (Bsep) y la proteína asociada a la resistencia a multidrogas 2 (Mrp2). No hay hasta el momento opciones terapéuticas específicas para esta enfermedad. El ácido ursodesoxicólico (AUDC) es la terapia de primera elección en la mayoría de las patologías colestásicas humanas. Esta sal biliar posee amplias propiedades hepatoprotectoras. 1) Es un ligando de activación de PXR y FXR, dos receptores nucleares responsables de sostener elevada la expresión de Mrp2 y Bsep. 2) Favorece la reinserción de transportadores canaliculares a su dominio de membrana que han sido endocitados por la injuria colestásica. 3) Puede contrarrestar la inflamación y el daño hepático inducido por ácidos biliares, a través de múltiples mecanismos. A pesar de su amplia utilización terapéutica, la eficacia del AUDC en la colestasis por endotoxemia aún no se ha evaluado, y este fue uno de los objetivos de este trabajo de tesis. Para ello, ratas Wistar macho se dividieron en 3 grupos experimentales: 1) Grupo Control: Se le administró por 5 días el vehículo del AUDC intraperitoneal (i.p.). 2) Grupo LPS: Se le administró el vehículo del AUDC por 5 días i.p. y LPS, en dosis de 4 mg/kg/día i.p., a las 8 am de los últimos 2 días, aplicándose una dosis extra de 2 mg/Kg i.p. a las 8 pm del último día antes de la cirugía. 3) AUDC+LPS: Recibió AUDC durante 5 días (25 mg/ Kg/día, i.p.), y los últimos dos días, LPS como se describió para el grupo anterior. Luego del tratamiento, se evaluó la fosfatasa alcalina (ALP) plasmática, el flujo biliar (FB), la velocidad de excreción de sales biliares (SB) (VESB) basales y estimulada por la SB sustrato de Bsep taurocolato (TC), la velocidad de excreción de glutatión total (VEGSH) (sustrato de Mrp2) y la expresión y localización de las proteínas hepáticas Bsep y Mrp2, mediante microscopía confocal. Los niveles de ARNm de ambos transportadores se evaluaron mediante Real-time PCR. Las citoquinas proinflamatorias (IL-6 y TNF-α) se midieron en plasma mediante ELISA. Nuestros resultados mostraron que el AUDC atenuó la liberación de ALP a plasma inducida por LPS y el impedimento en la excreción de los sustratos de Bsep, lo cual fue evaluado a través de la determinación de la velocidad de excreción de TC. Esto se asoció con una mejor expresión de Bsep tanto a nivel del ARNm como de la proteína, y con una apropiada localización del transportador en la membrana plasmática. El AUDC no logró reducir el aumento de las citoquinas proinflamatorias en plasma ni la disminución en la expresión y función de Mrp2 inducidos por LPS. En conclusión, el AUDC protege al hepatocito contra el efecto deletéreo de las SB acumuladas por la falla secretora inducida por LPS. Esto fue debido a una mejora en la síntesis de Bsep y una mejora en la estabilidad en la membrana de los transportadores sintetizados de novo. Debido a los efectos limitados del AUDC como agente terapéutico frente a la colestasis por LPS, particularmente su incapacidad para mejorar la función de Mrp2, decidimos evaluar otros fármacos con potencialidad para contrarrestar la patología por mecanismos diferentes. Se evaluó, consiguientemente, la espironolactona (SL), un ligando de PXR que se sabe está implicado en la homeostasis de SB y regula positivamente la expresión de Mrp2. Se han descripto también propiedades anti-inflamatorias de la SL en otros modelos. Para ello, ratas Wistar macho se dividieron en 3 grupos experimentales: 1) Grupo Control: Recibieron el vehículo de la SL por 3 días i.p. 2) Grupo LPS: Se administró a las 8 am de los últimos 2 días, en dosis de 2,5 mg/Kg/día i.p., más una dosis, de 1,5 mg/kg i.p., a las 8 pm del último día. 3) Grupo SL+LPS: Se administró SL por 3 días, en dosis de 83,3 mg/ Kg/día, i.p., y los últimos dos días LPS, como se describió para el grupo anterior. Luego, se evaluó el FB, la VESB basales y post estímulo con TC, la VEGSH, y de un sustrato exógeno del transportador Mrp2, la dibromosulfoftaleina (DBSF). Se determinaron también los niveles de ARNm y de las proteínas Mrp2 y Bsep en hígado, mediante Real-time PCR y Western blot, respectivamente. Asimismo, se analizó la localización de los transportadores por inmunofluorescencia seguida de microscopía confocal. Se determinaron los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en plasma mediante kits ELISA. Nuestros resultados muestran que la SL mejoró el FB. Además, mejoró la función y expresión, tanto a nivel del ARNm como de la proteína de Mrp2 y su localización en la membrana canalicular en ratas tratadas con LPS. No se observaron mejoras en la función de Bsep en los animales co-tratados, pero sí una mejora en la localización del transportador en membrana. Por otro lado, la SL no previno la elevación de las citoquinas en plasma. Inferimos que inductores de PXR podrían presentar efectos beneficiosos complementarios a los del AUDC, contrarrestando la disminución del flujo biliar inducida por LPS a través de mejorarar la excreción biliar de glutation vía inducción de Mrp2. Como conclusión final, nuestros resultados, muestran complementariedad terapéutica en los pretratamientos con AUDC y SL, sugiriendo que sería de relevancia evaluar posibles combinaciones de dichos tratamientos, como un modo de alcanzar una respuesta terapéutica más completa en esta patología.Ítem Acceso Abierto Mitogen-activated protein kinases are involved in hepatocanalicular dysfunction and cholestasis induced by oxidative stress(Springer, 2017-06) Toledo, Flavia D.; Basiglio, Cecilia Lorena; Barosso, Ismael R.; Boaglio, Andrea C.; Zucchetti, Andrés E.; Sanchez Pozzi, Enrique J.; Roma, Marcelo GabrielÍtem Acceso Abierto Physiological concentrations of unconjugated bilirubin prevent oxidative stress-induced hepatocanalicular dysfunction and cholestasis(Springer, 2014-02) Basiglio, Cecilia Lorena; Toledo, Flavia D.; Boaglio, Andrea C.; Arriaga, Sandra Mónica María; Ochoa, Justina E.; Sánchez Pozzi, Enrique Juan; Mottino, Aldo D.; Roma, Marcelo GabrielÍtem Acceso Abierto Radical oxygen species and bile secretion(Springer, 2014-05) Basiglio, Cecilia Lorena; Toledo, Flavia D.; Sánchez Pozzi, Enrique J.; Roma, Marcelo GabrielOxidative stress is a common feature in most hepatopathies. Accumulating evidences indicate that reactive oxygen species (ROS) induce a number of functional changes either deleterious or adaptive in the capability of the hepatocytes to produce bile and to secrete exogenous and endogenous compounds. This review is aimed to describe the mechanisms involved in these changes. For this purpose, we will summarize: 1. The current evidence that acutely induced oxidative stress is cholestatic, by describing the mechanisms underlying the hepatocyte secretory failure, including the disorganization of the actin cytoskeleton and its most noticeable consequences, that is, the impairment of tight-junctional structures and the endocytic internalization of canalicular transporters relevant to bile formation. 2. The role for oxidative-stress-activated signalling pathways in the pathomechanisms described above, particularly those involving Ca2+ elevation and its consequent activation via Ca2+ of “classical” and “novel” PKC isoforms. 3. The mechanisms involved in the adaptive response against oxidative stress mediated by ROS-responsive transcription factors, such as upregulation of GSH synthesis pathway, antioxidant enzymes, and hepatocellular efflux pumps. 4. The consequences on hepatocellular secretory function when this adaptive response can be surpassed by the sustained/high production of ROS. This deleterious effects include transcriptional and posttranscriptional changes in the expression of transporters relevant to bile formation, as has been shown to occur, for example, after long-term administration of aluminum to rats, in the Long-Evans Cinnamon rat (a model of chronic hepatic copper accumulation mimicking Wilson’s disease), and in ischemia-reperfusion injury.Ítem Acceso Abierto The Ca2+-calmodulin-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II pathway is involved in oxidative stress-induced mitochondrial permeability transition and apoptosis in rat hepatocytes(Springer, 2014-03-11) Toledo, Flavia D.; Pérez, Leonardo Martín; Basiglio, Cecilia Lorena; Ochoa, Justina E.; Sánchez Pozzi, Enrique Juan; Roma, Marcelo Gabriel