Examinando por Autor "Spampinato, Claudia P."
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Ítem Acceso Abierto Análisis funcional del complejo MutSγ de Arabidopsis thaliana(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2012-10-19) Gómez, Rodrigo Lionel; Spampinato, Claudia P.El sistema MMR, constituye uno de los pilares fundamentales del mantenimiento de la estabilidad génica de todos los organismos. Su funcionalidad está altamente relacionada a los pasos post replicativos, sin embargo, han sido propuestos roles adicionales del sistema entre los que se encuentra la corrección de lesiones oxidativas sobre el ADN. El sistema MMR se encuentra conservado desde organismos procariotas a eucariotas, presentando mayor complejidad en estos últimos. El paradigma bacteriano se estableció en primer lugar en E. coli donde existen tres homodímeros específicos del sistema denominados MutS, MutL y MutH. En eucariotas, se ha demostrado la existencia de parálogos de MutS (denominados MSHs) y de MutL (denominados MLH y PMS) que forman heterodímeros funcionales específicos. Sin embargo, no existen homólogos eucariotas de MutH. El primer paso del sistema involucra el reconocimiento de lesiones en el ADN, principalmente apareamientos incorrectos o desapareamientos de bases, por complejos del tipo MutS. En eucariotas existen dos heterodímeros conservados que difieren en su especificidad de reconocimiento de lesiones. El primero se denomina MutSα y está formado por las subunidades MSH2 y MSH6, mientras el segundo se denomina MutSβ y se encuentra conformado por las subunidades MSH2 y MSH3. En A. thaliana y otras plantas estudiadas existe un tercer parálogo de MutS denominado MSH7. Esta subunidad forma junto con MSH2 el complejo heterodimérico MutSγ. Existen numerosos estudios sobre el sistema MMR en bacterias, células humanas y levaduras, sin embargo, el conocimiento del mismo en plantas es aún escaso. Ante este escenario se planteó como uno de los objetivos del presente trabajo extender el conocimiento sobre el sistema MMR de plantas, principalmente centrándose en el rol del complejo MutSγ, exclusivo de estos organismos. Adicionalmente, se estudió la relación del sistema MMR con la reparación del daño oxidativo en el ADN. En primer lugar, se expresó la subunidad AtMSH2 en un sistema bacteriano y se purificó a homogeneidad con la finalidad de utilizar esta proteína en futuros ensayos bioquímicos in vitro. Adicionalmente, se utilizaron anticuerpos generados contra esta subunidad para demostrar la existencia de un ortólogo de MSH2 en inflorescencias de Brassica olaracea, especie relacionada filogenéticamente con A. thaliana. La presencia de la proteína en inflorescencias sería importante para mantener la fidelidad genética durante la siguiente generación. De hecho, también se observó que los niveles transcripcionales del gen MSH2 en A. thaliana son 70 veces superior en callos con respecto a los valores de plántulas, asociado probablemente a la mayor tasa de replicación existente en estos tejidos. Los niveles de expresión de los genes MSH2, MSH6, MLH1 y PMS1, también, se evaluaron en plantas salvajes sometidas a condiciones de estrés oxidativo, por tratamiento con MV y estrés salino, por tratamiento con NaCl. En general, todos los genes mostraron un aumento en su expresión en relación a las condiciones control, sin embargo, los incrementos dependieron del gen en estudio y del tratamiento. AtPMS1 fue el único gen que mostró una disminución en su expresión relativa cuando se estudió el efecto de NaCl. Estos experimentos se extendieron a estudiar el efecto del estrés oxidativo y salino en plantas de A. thaliana salvajes o mutantes en el gen MSH2. Se observaron disminuciones de las cantidades de clorofilas a y b y en la elongación de raíces, tanto en plantas salvajes (control) como en plantas mutantes sometidas a tratamientos de estrés. Adicionalmente, se observó una mayor acumulación de bases oxidadas, 8-oxoG, en el ADN de plantas sometidas a estrés oxidativo, sin evidenciarse diferencias atribuibles a los genotipos. En conjunto, estos datos no permiten establecer una relación directa entre el sistema MMR y la reparación del daño oxidativo en el ADN. Finalmente, se caracterizó la función de AtMutSγ en un sistema in vivo. Para ello, se expresaron las subunidades AtMSH2 y AtMSH7 en un huésped heterólogo. La expresión funcional del complejo se confirmó mediante ensayos de cambios de movilidad electroforética y medidas de tasas de mutaciones de distintos marcadores moleculares. A partir de la comparación de las tasas de mutaciones, se determinó que la expresión de AtMutSγ produce un aumento en la frecuencia de mutaciones del tipo de sustitución de bases en el ADN, evidenciada por uno de los genes reporteros utilizados (CAN1). El análisis del espectro mutacional de CAN1 permitió confirmar que el aumento en la tasa de mutaciones se debe a sustituciones de bases. Adicionalmente, los resultados obtenidos permitieron inferir cierta especificidad de reconocimiento de AtMutSγ, mediante la prevalencia de ciertas sustituciones sobre las demás. Estas sustituciones involucran los cambios de T por A, C o G y de G por A en la hebra codificante del CAN1. De esta forma, AtMutSγ reconocería preferencialmente los apareamientos incorrectos que causan estas mutaciones. Estos datos, abren nuevas perspectivas para continuar avanzando en la elucidación de las bases moleculares y bioquímicas de este sistema de reparación en plantas.Ítem Acceso Abierto Candida infections, causes, targets, and resistance mechanisms: traditional and alternative antifungal agents(Hindawi, 2013) Spampinato, Claudia P.; Leonardi, Darío; https://orcid.org/0000-0003-2292-3570The genus Candida includes about 200 different species, but only a few species are human opportunistic pathogens and cause infections when the host becomes debilitated or immunocompromised.Candida infections can be superficial or invasive. Superficial infections often affect the skin or mucous membranes and can be treated successfully with topical antifungal drugs. However, invasive fungal infections are often life-threatening, probably due to inefficient diagnostic methods and inappropriate initial antifungal therapies. Here, we briefly review our current knowledge of pathogenic species of the genus Candida and yeast infection causes and then focus on current antifungal drugs and resistance mechanisms. An overview of new therapeutic alternatives for the treatment of Candida infections is also provided.Ítem Acceso Abierto Efecto del daño al ADN por UV-B en plantas: estudio de la interacción de proteínas remodeladoras de la cromatina y el sistema de reparación de bases incorrectamente apareadas(2013) Lario, Luciana Daniela; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.La luz es uno de los factores más importantes que regulan el crecimiento y el desarrollo de las plantas. Sin embargo, el aumento de la radiación UV-B, debido a la acción antropogénica, puede tener un impacto negativo en los cultivos, debido a una disminución de la producción de biomasa. A nivel molecular, esta radiación provoca lesiones en el ADN, las cuales, si no son reparadas, perturban el metabolismo celular al impedir que ocurran los procesos de transcripción y replicación del genoma. Por tal motivo, los organismos eucariotas han desarrollado eficientes mecanismos de reparación del ADN, y han coordinando estos procesos con el remodelado de la cromatina y con la regulación del progreso del ciclo celular. El este trabajo de Tesis, se procedió a analizar la respuesta de las plantas frente al daño producido en el ADN por la radiación UV-B. En primer lugar, se encontró que los genes codificantes del heterodímero MutSα (MSH2 y MSH6), y de las chaperonas de histona ASF1 (ASF1A y ASF1B), se inducen en presencia de UV-B, y estarían involucrados en la reparación de CPDs. Además, se observó que MSH2 participaría en la señalización del arresto del ciclo celular, en respuesta al daño producido en el ADN por esta radiación. Por otra parte, se corroboró que los genes ASF1 y MSH se encuentran regulados por el ciclo celular, presentando un máximo de expresión durante la fase S. Además, se determinó que MSH6, ASF1A y ASF1B son blancos de regulación de los factores de transcripción E2F, y que la expresión de algunos de dichos factores (E2Fa-E2Fd), a su vez, se modula por la radiación UV-B. Finalmente, mediante ensayos de coinmunoprecipitación, se encontró que las proteínas ASF1 interaccionan con las histonas H3 y H4 acetiladas en sus extremos N-terminales, y con las proteínas acetiltransferasas HAM1/HAM2, cuyo homólogo en humanos, denominado Tip60, se encuentra involucrado en la activación del arresto del ciclo celular y en la reparación del ADN en respuesta al estrés genotóxico. Estos resultados confirman la regulación coordinada de los genes involucrados en la reparación del ADN, el remodelado de la cromatina, y el arresto del ciclo celular, en respuesta al daño al ADN provocado por la radiación UV-B en plantas.Ítem Acceso Abierto Molecular fingerprints to identify Candida species(Hindawi, 2013-06-17) Spampinato, Claudia P.; Leonardi, DaríoA wide range of molecular techniques have been developed for genotyping Candida species. Among them, multilocus sequence typing (MLST) and microsatellite length polymorphisms (MLP) analysis have recently emerged. MLST relies on DNA sequences of internal regions of various independent housekeeping genes, while MLP identifies microsatellite instability. Both methods generate unambiguous and highly reproducible data. Here, we review the results achieved by using these two techniques and also provide a brief overview of a new method based on high-resolution DNA melting (HRM). This method identifies sequence differences by subtle deviations in sample melting profiles in the presence of saturating fluorescent DNA binding dyesÍtem Acceso Abierto Optimization of protease production and sequence analysis of the purified enzyme from the cold adapted yeast Rhodotorula mucilaginosa CBMAI 1528(Elsevier, 2020-10-21) Lario, Luciana Daniela; Pillaca-Pullo, Omar Santiago; Sette, Lara Durães; Converti, Attilio; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.; Pessoa, AdalbertoEnzymes from cold-adapted microorganisms are of high interest to industries due to their high activity at low and mild temperatures, which makes them suitable for their use in several processes that either require a supply of exogenous energy or involve the use of heat labile products. In this work, the protease production by the strain Rhodotorula mucilaginosa CBMAI 1528, previously isolated from the Antarctic continent, was optimized, and the purified enzyme analyzed. It was found that protease production was dependent on culture medium composition and growth temperature, being 20 C and a culture medium containing both glucose and casein peptone (20 and 10 g/L, respectively) the optimal growing conditions in batch as well as in bioreactor. Moreover, mass spectrometry analysis revealed that the enzyme under study has a 100 % sequence identity with the deduced amino acid sequence of a putative aspartic protease from Rhodotorula sp. JG-1b (protein ID: KWU42276.1). This result was confirmed by the decrease of 95 % proteolytic activity by pepstatin A, a specific inhibitor of aspartic proteases. We propose that the enzyme reported here could be Rodothorulapepsin, a protein characterized in 1972 that did not have an associated sequence to date and has been classified as an orphan enzyme.Ítem Acceso Abierto Ribosomal protein RPL10A contributes to early plant development and abscisic acid-dependent responses in Arabidopsis(Frontiers Media, 2020-11-05) Ramos, Rocío Soledad; Casati, Paula; Spampinato, Claudia P.; Falcone Ferreyra, María LorenaÍtem Embargo Rol del sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN en la respuesta de las plantas al estrés(2022) Chirinos Arias, Michelle Christine; Spampinato, Claudia P.Existen diversos mecanismos de reparación del ADN que ayudan a mantener la integridad del genoma, uno de ellos es el sistema de reparación de apareamientos incorrectos o MMR (por sus siglas en inglés, Mismatch Repair). Dentro del sistema MMR, las proteínas MSH son las encargadas de reconocer la lesión del ADN, siendo MSH7 una proteína exclusiva de las plantas. Con el objetivo de comprender mejor el rol de las proteínas MSH de diferentes plantas de interés agronómico, el capítulo 3 describe varios estudios in silico a nivel de genes, proteínas e interacciones. Los resultados obtenidos demuestran que las proteínas MSH ortólogas no solo cumplen con la función durante la reparación de ADN, sino que podrían estar involucradas en la regulación del ciclo celular, en el desarrollo embrionario y en la recombinación mitótica o meiótica, funciones que se conservan en las especies de interés agronómico estudiadas. El capítulo 4, se centra en dilucidar el rol de MSH7 en Arabidopsis thaliana mediante la caracterización de varios rasgos morfológicos y del desarrollo de mutantes msh7, mientras que, el capítulo 5 permite comprender mejor la función de MSH7 en las plantas expuestas a un estrés salino agudo, mediante diversos ensayos fenotípicos, histoquímicos, enzimáticos, bioinformáticos y de citometría de flujo. Los resultados obtenidos indican que la deficiencia de MSH7 aumenta la tasa de la germinación, la longitud de las raíces primarias y el número de hojas caulinares, inflorescencias y silicuas. Además, se observó por citometría de flujo una desregulación del ciclo celular en los meristemas apicales de las plántulas mutantes msh7 en condiciones control. En cuanto al tratamiento salino, se observó que las plántulas mutantes msh7 se afectaron menos que las del genotipo salvaje. El menor efecto inhibitorio en las mutantes msh7 se evidenció por una menor reducción de las áreas de la roseta y foliar, de la densidad estomática, del número total de hojas, de la longitud de la silicua y del número de semillas por silicua. Finalmente, el capítulo 6 estudia el efecto del tratamiento salino en la estabilidad del genoma de la décima generación (G10) de las plantas mutantes msh7 utilizando marcadores moleculares de intersecuencia (ISSR, del inglés Inter Simple Sequence Repeats) y análisis de alta resolución de la curva de disociación (HRM, del inglés High Resolution Melting). Se observó que el estrés salino afectó la estabilidad genómica de las plántulas de la G10, indicando que MSH7 es importante en la conservación de la estabilidad genómica transgeneracionalmente.