Ottado, Jorgelina2023-08-042023-08-042023http://hdl.handle.net/2133/26111Los herbicidas de amplio espectro basados en glifosato (GP) (del inglés “Glyphosate Based Herbicides”, GBH) se han convertido en los más utilizados a nivel mundial. El GP (C3H8NO5P) es un miembro del grupo de compuestos químicos denominados fosfonatos, caracterizados por poseer el enlace carbono-fósforo (C-P). El uso extensivo de GBH, ha provocado que residuos de GP y de su principal metabolito de degradación, el ácido amino metilfosfónico (AMPA); se encuentren ampliamente distribuidos en el ambiente. Con la necesidad de prevenir la contaminación de los ambientes naturales y de buscar alternativas para su control y tratamiento, la biorremediación se ha considerado como una de las tecnologías más eficientes. En este contexto, en este trabajo de Tesis, se han aislado bacterias capaces de degradar el GP a partir de suelos de la provincia de Santa Fe con historia de repetidas aplicaciones con este herbicida. De un total de 62 aislamientos bacterianos con capacidad de crecer en presencia GBH como única fuente de fósforo, encontramos 13 especies diferentes pertenecientes a los géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Ochrobactrum, Pseudomonas y Pantoea. Se han caracterizado los perfiles de degradación del GP, GBH y AMPA de estos aislamientos bacterianos y la mayor eficiencia de degradación, se observó para las bacterias de los géneros Achromobacter, Agrobacterium y Ochrobactrum. El genoma de Agrobacterium tumefaciens CHLDO, seleccionada por ser una de las cepas que más eficientemente degrada el GBH, se secuenció y reveló la presencia de un grupo de genes phn (phnFGHJIKLOCDE2E1-duf1045phnNM), responsable de la metabolización de fosfonatos a través de la vía C-P liasa. El análisis de la expresión de los genes phn de A. tumefaciens CHLDO al crecer en presencia de GBH, o fosfato inorgánico como únicas fuentes de fósforo, mostró una inducción del cluster phn en presencia del herbicida, lo que sugiere una fuerte participación de esta vía en la degradación del GP. Además, la introducción de este cluster phn de A. tumefaciens CHLDO en el chassis heterólogo derivado de Pseudomonas putida KT2440, modificado para ser un auxótrofo de glicina (GLY), denominada SLTB7, permitió estudiar la degradación del GP a través de la vía C-P liasa. Dado que la GLY es un subproducto de la degradación de GP por esta vía, se ha desafiado a la degradación del GP acoplada al crecimiento bacteriano. La sobreexpresión del cluster phn demostró que la cepa SLTB7 es capaz de tolerar más el efecto de inhibición del crecimiento dado por el GP que la cepa control, aunque no es suficiente para revertir el fenotipo de auxotrofía. También se estudió la enzima blanco para el GP, conocida como EPSPS, de A. tumefaciens CHLDO (EPSPS_CHLDO). Esta enzima es esencial en plantas y microorganismos, por lo que su estudio es fundamental para determinar los efectos producidos por el GP en el ambiente. Se realizó un análisis in silico de las secuencias aminoacídicas de estas enzimas y se demostró que pertenecen a la clase III, tipo resistentes al GP. Además, la sobreexpresión de EPSPS_CHLDO en un plásmido o su inserción en el genoma de P. putida SLTB, generó una cepa más resistente al GP que la cepa parental. Por último, del análisis de los seis posibles promotores asociados al cluster phn de A. tumefaciens CHLDO, se pudo obtener dos biosensores para detectar la presencia de fosfonatos en el medio, basados en la región promotora del gen phnG. Asimismo, se realizó un biosensor que permite la detección de concentraciones de fosfato inorgánico (Pi) en el medio. Este último fue diseñado en base a la región promotora del gen phnC y respondió de manera inversamente proporcional a la concentración de Pi. En resumen, en esta Tesis se han aislado bacterias nativas con alta eficiencia de degradación de GP a partir de muestras ambientales; y los mecanismos moleculares involucrados en este proceso fueron transferidos a cepas bacterianas heterólogas. Los resultados obtenidos sientan las bases para la obtención de herramientas biotecnológicas que permitirán detectar y eliminar este herbicida del medio ambiente.application/pdfspaembargoedAccessBiorremediaciónGlifosatoBacteriasAgriculturaPseudomonasBiosensor basado en factor de transcripcióndoctoralThesisMasotti, FiorellaUniversidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y FarmacéuticasAtribución-NoComercial-SinDerivadas 2.5 Argentina (CC BY-NC-ND 2.5 AR)