Examinando por Autor "Gil Rosas, Mauco Lucas"
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Ítem Embargo Regulación de TCOF1 por CNBP: posibles implicancias en el Síndrome de Treacher Collins(2022) Gil Rosas, Mauco Lucas; Coux, GabrielaLas mutaciones en el gen TCOF1, que codifica una proteína nucleolar involucrada en el metabolismo del ARN ribosomal, explican más del 80% de los casos de Síndrome de Treacher Collins (TCS, de sus siglas en inglés), una enfermedad congénita de expresividad variable caracterizada por una serie de anomalías craneofaciales. El TCS resulta de la interferencia en la migración y la proliferación de las células de la cresta neural (CN) craneal, en donde CNBP juega un rol esencial mediante el control de la proliferación y la supervivencia de las células. Recientemente se identificó una correlación en la expresión de TCOF1 y CNBP en células mesenquimales humanas. Además, en un modelo de TCS en Danio rerio, las evidencias sugirieron que la patogenia del TCS involucra un aumento de las especies reactivas del oxígeno (de sus siglas en inglés ROS) y una degradación por vía proteasomal de Cnbp, la cual se comportó como una proteína citoprotectora. CNBP es, además, una chaperona de ácidos nucleicos cuyos sitios consenso de unión al ADN suelen coincidir con sitios putativos de formación de cuádruplex de guanina (G4), conformaciones no canónicas de los ácidos nucleicos que actúan como reguladoras de múltiples procesos celulares. En este sentido, CNBP ha sido reportada como una proteína que tiene la capacidad de unirse y desplegar estas estructuras ricas en guanina. En este Trabajo de Tesis profundizamos el estudio del vínculo entre CNBP, TCOF1 y el TCS. Los análisis bioinformáticos sobre las regiones promotoras de TCOF1 en H. sapiens y en D. rerio detectaron secuencias con la potencialidad de formar G4, dos secuencias en el gen humano (Hs791 y Hs2160) y una en pez cebra (Dr2393). Estas secuencias presentaron la particularidad de solaparse con sitios putativos de unión de CNBP. A través de distintos ensayos espectroscópicos corroboramos el plegamiento de las secuencias como G4. Mediante ensayos de ChIP y EMSA se pudo demostrar la unión de CNBP a las tres secuencias y se determinaron sus Kds. Los G4 Hs2160 (pero no Hs791) y Dr2393 fueron capaces de modular la transcripción de luciferasa expresada bajo el control de un promotor constitutivo en células HeLa. Ambos G4 produjeron un aumento de la expresión de luciferasa, sugiriendo un comportamiento de estas dos secuencias como activadores de la transcripción. La interrupción del plegamiento de Dr2393 mediante la microinyección de oligonucleótidos anti sentido (ASO) específicos produjo embriones de pez cebra con un fenotipo comparable al del TCS, y los niveles de expresión de tcof1 disminuidos. El knock-down de cnbp en embriones de pez cebra mostró un aumento transcripcional de tcof1. Por otro lado, la incubación de los embriones de D. rerio modelo de TCS con inhibidores de proteasoma (IP) produjo una reversión parcial del fenotipo junto con una preservación de los niveles proteicos de Cnbp y un aumento de los niveles transcripcionales de cnbp. También se detectó una disminución de la apoptosis en la región cefálica y una disminución de los niveles de ROS característicos del TCS. Los resultados recopilados en este Trabajo de Tesis sugieren que: i) el G4 Hs2160 en el gen TCOF1 actúa como activador transcripcional, y la expresión transcripcional de TCOF1 está modulada por CNBP a través de un mecanismo que involucra el plegado/desplegado de G4. Esta regulación se encuentra conservada en vertebrados, según sugieren nuestros resultados para el G4 Dr2393. ii) En el modelo de TCS en embriones de pez cebra, los niveles conservados de Cnbp debido al tratamiento con IP, pueden explicar las mejorías en las manifestaciones fenotípicas: el mantenimiento del balance redox intracelular mediante la acción citoprotectora de Cnbp prevendría la muerte celular neuroepitelial inducida por estrés oxidativo preservando un número suficiente de células para la posterior formación del esqueleto craneofacial. Estos resultados podrían tener implicancias terapéuticas potenciales en el manejo del TCS.