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Ítem Acceso Abierto Bases moleculares de la biogénesis de microARNs en plantas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-28) Moro, Belén; Palatnik, Javier F.; Rasia, Rodolfo M.Los microARNs (miARN) son ARN pequeños de ~20-22nt, de codificación endógena, que regulan múltiples rutas biológicas a través de la modulación de la expresión génica. En plantas controlan el desarrollo, la señalización hormonal y la respuesta al estrés. En humanos, se considera que el 60% de los genes están regulados por miARNs. Los miARNs reconocen a sus genes blancos por complementariedad de bases, y los guían a su degradación o inactivación traduccional. La especificidad de la interacción miARN-ARN mensajero (ARNm) ha permitido el diseño de miARNs artificiales para silenciar genes de interés. Los miARNs son procesados a partir de largos precursores con extensa estructura secundaria. Estos precursores son cortados por ribonucleasas del tipo III, como DICER LIKE1 (DCL1) en plantas. DCL1 realiza al menos dos cortes sobre el ARN doble hebra (ARNdh) y libera al miARN maduro, de ~21nt, junto a la hebra complementaria del mismo, denominada miARN*. DCL1 es asistida por otras proteínas, como la proteína de unión a ARN doble hebra, HYPONATIC LEAVES1 (HYL1) y la proteína de dedos de zinc SERRATE (SE). Tanto en plantas como en animales el precursor del miARN contiene pistas espaciales que determinan la posición del miARN a lo largo de su secuencia. Mientras que los precursores de animales presentan un tamaño uniforme, los precursores de plantas representan una colección de tamaños y formas variables que pueden ser procesados mediante cuatro mecanismos diferentes. La biogénesis de los miARNs es un proceso clave porque determina la secuencia exacta de nucleótidos del ARN pequeño funcional y por ende los genes regulados por él. Para responder a este interrogante desde un punto de vista genómico hemos desarrollado una técnica denominada SPARE (del inglés, “Specific Parallel Amplification of RNA Ends) que permite analizar los intermediarios de procesamiento de todos los precursores de Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos mediante la técnica de SPARE en conjunto con mutagénesis dirigida de los precursores de miR171, miR156/miR157 y mIR319 nos ha permitido caracterizar mecanismos de procesamiento exclusivos de plantas que implican el reconocimiento de la porción apical del precursor y la actividad de corte sucesiva de DCL1. A su vez el análisis global del procesamiento de miARN, nos llevó a proponer que la biogénesis de miARNs en plantas depende de la dirección de procesamiento del precursor, el número de cortes necesarios para liberar el miARN maduro y el determinante estructural que es reconocido para ubicar la posición del primer corte.Ítem Embargo Biogénesis y Actividad de miARNs en Arabidopsis thaliana(2022) Bresso, Edgardo Gabriel; Palatnik, Javier F.; Schommer, CarlaEl control del desarrollo de los distintos órganos involucra la acción conjunta de múltiples redes regulatorias y vías de señalización. Los microARNs (miRNAs) son pequeños ARNs de ~21 nt con importantes roles en la regulación de la expresión génica postranscripcional de eucariotas. Ejercen su función mediante el reconocimiento de secuencias complementarias en mensajeros de ARN regulados, provocando su corte y degradación o arresto traduccional. El módulo regulatorio miR319/TCP se encuentra altamente conservado en plantas, y cumple roles clave en múltiples vías del desarrollo de estos organismos, desde el desarrollo a la senescencia de la hoja, control de la curvatura del órgano, floración, y la biosíntesis y señalización hormonal. En este trabajo, comenzamos realizando un detallado estudio morfológico de hojas de plantas con niveles alterados de los factores de transcripción TCP regulados por el miR319 para caracterizar a nivel celular el rol de este nodo regulatorio en el desarrollo de este órgano. Demostramos que la ganancia de función disminuye la complejidad y tamaño del órgano con una reducción del número de células que lo componen. La pérdida de función a nivel de mutantes simples, dobles y triples en los TCP conlleva, un aumento aditivo en el tamaño de la hoja que se encuentra asociado a un mayor número de células pero más pequeñas. Cuando los niveles de los factores de transcripción estudiados se reducen a menores niveles, siendo la combinación de tres mutantes el punto de transición, los efectos observados se manifiestan como sinérgicos. El fenotipo de la hoja de estas plantas con niveles muy bajos de los TCP evoluciona hacia un aumento de la complejidad del órgano por efectos drásticos en los márgenes. Mediante un estudio de microarreglos y posterior validación, identificamos un nuevo blanco de regulación de los TCP que los vinculan con el control directo de la maquinaria de proliferación celular, algo hasta el momento desconocido. Realizamos un exhaustivo estudio de transcriptómica mediante secuenciación de ARN para caracterizar los perfiles de expresión del margen y centro de la hoja de Arabidopsis thaliana y los efectos de la pérdida de función de los TCP, identificando grupos de genes expresados diferencialmente en cada dominio y su implicancia para el desarrollo del órgano. En segundo lugar, caracterizamos por primera vez el rol del nodo regulatorio miR319/TCP en el desarrollo de la raíz de Arabidopsis. Demostramos que la ganancia de función de estos factores de transcripción afecta negativamente el crecimiento del órgano alterando la organización del meristema apical de la raíz. Además, mostramos que la pérdida de función de los TCP no produce efectos sobre el desarrollo y crecimiento del órgano, en concordancia con nuestras observaciones de que en condiciones normales el miR319 posee una alta actividad en la raíz. Al integrar todos los resultados, podemos postular un nuevo modelo sobre la importancia de este módulo regulatorio para el desarrollo de Arabidopsis, que potencialmente puede extenderse a otras especies vegetales, dada su amplio grado de conservación. En hoja, el miARN regula cuantitativamente a sus blancos permitiendo un adecuado balance entre proliferación y diferenciación celular. En raíz, el rol del miARN es eliminar completamente los transcriptos de los TCP para permitir el correcto desarrollo del órgano, el cual afectan negativamente. En conjunto, este trabajo de Tesis evidencia la naturaleza dinámica de la regulación por miARNs en plantas, de manera que un mismo nodo regulatorio puede alterar su estrategia de funcionamiento y su rol final en base a las necesidades del contexto celular en el que se encuentre.Ítem Acceso Abierto Control de la proliferación y diferenciación celular en plantas por microARNs(2019) Beltramino, Matías; Palatnik, Javier F.El tamaño final de los órganos está determinado mayormente por la extensión de una fase inicial de proliferación celular, seguida de una fase de expansión y diferenciación celular. El control de estos procesos involucra la acción concertada de varias vías de señalización hormonal y de redes de factores de transcripción, los cuales pueden, a su vez, ser regulados por miARNs. Los microARNs (miARNs) son ARN pequeños de 20-21 nucleótidos y constituyen un sistema ampliamente distribuido para controlar la expresión génica. El miARN miR396 regula los factores de transcripción de la familia GROWTH REGULATING FACTORs (GRFs). Estos factores de transcripción se caracterizan por presentar dos dominios conservados llamados WRC y QLQ, que median la unión al ADN y la interacción con otras proteínas, respectivamente. En Arabidopsis thaliana, siete de los nueve GRFs son regulados por miR396. A su vez, los GRFs forman complejos con los GRF-INTERACTING FACTORS (GIFs). El sistema miR396/GRFs se encuentra conservado en angiospermas y gimnospermas. Los GRFs estimulan la proliferación celular, mientras que la represión de los mismos por el miARN miR396 detiene la división celular y dispara la diferenciación. Durante el desarrollo de la hoja este sistema regulatorio tiene un rol fundamental en la determinación el tamaño y forma del órgano, así como también participa en el control de la senescencia. En este trabajo de tesis, en primer lugar, se analizó el control del balance miR396/GRFs como potencial herramienta biotecnológica. Obtuvimos plantas con hojas más grandes a través de la reducción de la actividad de miR396. Demostramos que versiones resistentes a la regulación de miR396 de los genes de Arabidopsis thaliana AtGRF2 (rGRF2) y AtGRF3 (rGRF3) aumentan el tamaño de las hojas, pero que rGRF3 resulta ser más eficiente. La introducción de At-rGRF3 en Brassica oleracea produce aumento de hojas, raíz y semillas. Además, cuando genes homólogos At-rGRF3 de soja y arroz son introducidos en Arabidopsis, también se incrementa el tamaño de la hoja. Esto sugiere que la regulación de miR396 sobre GRF3 es importante para el control del crecimiento de los órganos en un amplio rango de especies. Las plantas que expresan rGRF3 presentaron hojas más grandes que las silvestres, incluso en condiciones de estrés por sequía, estado en el cual se estimula la expresión de miR396. Por otro lado, se analizó la evolución de la regulación de miR396 sobre los GRFs y se encontró que la relación se encuentra ampliamente conservada evolutivamente. En la mayoría de las especies de dicotiledóneas todos los genes GRF están regulados por miR396. Sin embargo, observamos que dentro de las Brasicáceas existe un subgrupo de genes GRFs que han perdido dicha regulación. En Arabidopsis thaliana, estos genes son GRF5 y GRF6. Posiblemente, el subgrupo de GRFs no regulados por miR396 provenga de un único ancestro común que perdió originalmente la regulación. Estudios sobre AtGRF5 muestran que presenta funciones redundantes con los GRFs involucrados en el control del tamaño de la hoja y regulados por miR396. Análisis del promotor de GRF5 mostraron secuencias altamente conservadas en las Brasicáceas. En particular, la eliminación de uno de estos motivos conservados causa la expresión ectópica de GRF5. Estos resultado sugieren que la expresión de GRF5 se controla por represión transcripcional, en contraste con los otros GRFs reprimidos post-transcripcionalmente por miR396. A partir del análisis de distintos candidatos, identificamos que el represor transcripcional es el factor de transcripción AUXIN RESPONSE FACTOR2 (ARF2). Mutantes por perdida de función de arf2 presentan efectos fenotípicos pleiotrópicos, incluyendo hojas más grandes, que se asemejan a los observados en plantas que sobreexpresan GRF5. Un análisis de mutantes arf2 reveló que presentan incremento de los niveles de expresión de GRF5 y otros GRFs. Finalmente, a través de análisis genéticos y moleculares describimos como ARF2 controla la proliferación celular en hojas a través de GRF5. En forma más general, describimos una red regulatoria donde se vincula a ARF2 con el sistema de miR396/GRFs/GIFs en el control de la proliferación celular durante el desarrollo de las hojas.Ítem Acceso Abierto Control del crecimiento y desarrollo de las plantas por medio del sistema GRF(2021) Ferela, Antonella; Palatnik, Javier F.La familia de factores de transcripción (FT) GRFs (del inglés, GROWTH-REGULATING FACTORS) es específica de plantas y se caracteriza por ser regulada post-trascripcionalmente por el microARN (miARN) miR396. A su vez, los GRFs actúan en conjunto con miembros de una familia génica de co-reguladores transcripcionalesllamada GIF (del inglés, GRF-INTERACTING FACTORS). El nodo miR396-GRF/GIF cumple importantes funciones en diversos procesos del desarrollo de la planta. Los GRFs en Arabidopsis son capaces de modificar el tamaño de las hojas y flores controlando la proliferación celular en las primeras etapas del desarrollo como así también el proceso de senescencia de las hojas. En este trabajo de Tesis se propuso descifrar las redes génicas reguladas por el sistema GRF utilizando Arabidopsis thaliana como organismo modelo. Además, se planteó caracterizar el sistema GRF/GIF en trigo. En una primera instancia se analizaron microarreglos de plantas con distintos niveles de expresión de los GRFs. Se encontró que la familia de FT ZF-HDs (del inglés, ZINC FINGERS HOMEODOMAIN), sería regulada positivamente por los GRFs. El estudio de cruzas de plantas que expresan un miARN artificial contra la familia ZF-HD (amiRZF-HDs) con plantas con niveles aumentados de GRF3 indicó que los genes de la familia ZF-HDs se expresarían corriente abajo de GRF3. El análisis del promotor de HB33, uno de los miembros de la familia ZF-HDs, indicó que el mismo presentaba el motivo de unión al ADN propuesto para los GRFs y mediante ChIP-qPCR (Inmunoprecipitación de la Cromatina seguido de PCR cuantitativa) se validó esta interacción. La mutante simple de HB33 no mostró defectos significativos en su crecimiento y desarrollo. Sin embargo, la expresión de HB33 fusionado a un dominio super-represor resultó en plantas con severos defectos en el desarrollo, indicando la importancia de esta familia de genes en el desarrollo temprano de Arabidopsis. Al sobre-expresar HB33 de forma moderada se encontró que las plantas presentaban hojas más grandes que las silvestres y con retardo en la senescencia de las hojas, fenotipo semejante al observado en las plantas con altos niveles de GRF3. Estos fenotipos se pudieron desacoplar expresando a HB33 bajo el control del promotor ANT (AINTEGUMENTA), que se expresa solo en el desarrollo temprano de la hoja. Las plantas pANT:HB33 presentaron aumento del tamaño de la hoja sin afectar la senescencia. A su vez, la cruza de rGRF3 con hb33 suprimió el retardo en la senescencia característico de rGRF3. Estos resultados indican que HB33 sería regulado directamente por GRF3 y tendría implicancias tanto en procesos tempranos del desarrollo de la hoja como en el proceso de senescencia. Luego, se realizaron experimentos de transcriptómica utilizando ápices y puntas de raíces de plantas de Arabidopsis transformadas con versiones inducibles de GIF1 y/o GRF3. En raíces, se encontró que luego de la inducción varios genes implicados en el mantenimiento del meristema fueron reprimidos, mientras que, en parte aérea se encontraron incrementados genes con funciones conocidas en el ciclo celular y en la replicación del ADN. El estudio de los genes blancos del sistema GRF/GIF en los dos meristemas analizados sugiere que el sistema participa en redes regulatorias génicas diferentes en los distintos órganos de las plantas. Por último, en colaboración con el laboratorio del Dr. Jorge Dubcosvky, se estudió el sistema miR396-GRF/GIF en trigo utilizando una población de mutantes TILLING (del inglés, Targeted Induced Local Lesion in Genomes) en trigo tetraploide secuenciada. Primero se determinaron los homólogos de los GRFs en trigo y se seleccionaron mutantes en el sitio de unión de miR396 en los GRFs de la población TILLING. Luego de realizar cruzamientos para limpiar las líneas de otras mutaciones se analizaron las correspondientes plantas. Se encontró aumento en el tamaño de los granos en dos de las líneas mutantes. Conjuntamente, se caracterizaron plantas sobre-expresantes del cofactor GIF1. Estas plantas presentaron aumento en el largo de las hojas e incremento en el tamaño de los granos. Los resultados preliminares en trigo son alentadores sugiriendo que modificaciones en este sistema pueden utilizarse para aumentar el rendimiento de este cereal.Ítem Acceso Abierto Efficiency and precision of microRNA biogenesis modes in plants(Oxford University Press, 2018-10-05) Moro, Belén; Chorostecki, Uciel Pablo; Arikit, Siwaret; Suárez, Irina Paula; Höbartner, Claudia; Rasia, Rodolfo M.; Meyers, Blake C.; Palatnik, Javier F.Ítem Acceso Abierto Estudios sobre la regulación de la expresión génica por microARNs en plantas mediante estrategias bioinformáticas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-05-22) Chorostecki, Uciel Pablo; Palatnik, Javier F.Los microARNs (o miARNs) son ARN no codificantes que regulan la expresión génica en animales y plantas, y están implicados en procesos biológicos muy variables, como el desarrollo, la diferenciación y el metabolismo. Con un largo de aproximadamente 21 nucleótidos, los miARNs reconocen secuencias parcialmente complementarias en los ARNm blanco, provocando su corte o arresto de la traducción. Los miARNs han saltado rápidamente a la primera plana del interés de la comunidad científica como un nuevo nivel en el control de la expresión génica en eucariotas. Estudios recientes han puesto de manifiesto que los miARNs están implicados en distintas patologías de seres humanos. Los cálculos actuales consideran que cerca del 40% de los genes de humanos se encuentran regulados por miARNs. Está generalmente aceptado que los miARNs en plantas tienen una extensiva complementariedad con sus genes blanco y su predicción por lo general se basa en el uso de parámetros empíricos deducidos de interacciones conocidas y validadas experimentalmente. En este trabajo, primero desarrollamos una estrategia para la identificación de genes blanco regulados por miARNs en plantas, basado en la conservación evolutiva del par miARN-gen blanco. Además, pudimos encontrar genes blanco específicos de Solanaceae y demostrar que la estrategia se puede utilizar para la búsqueda de genes blanco pertenecientes a un grupo determinado de especies. Esta estrategia fue usada para predecir nuevas interacciones no conocidas anteriormente en Arabidopsis thaliana, que luego fueron validados experimentalmente. Algunos de los nuevos genes identificados podrían participar de las mismas vías que genes blanco conocidos anteriormente, sugiriendo que algunos miARNs pueden controlar diferentes aspectos de un proceso biológico. A partir de estos resultados, desarrollamos una herramienta bioinformática disponible en un servidor de acceso público para identificar genes blanco de miARNs basada principalmente en la conservación durante la evolución de la interacción del par miARN-gen blanco en distintas especies. La herramienta también brinda una descripción de varios parámetros de las interacciones miARN-gen blanco en distintas especies, que puede ser útil para mejorar los sistemas de predicción y describir la co-evolucion de los miARNs y los genes blanco. La biogénesis de los miARNs es un proceso clave porque determina la secuencia exacta de nucleótidos del ARN pequeño funcional, que luego determina los genes a ser regulados. Los precursores de miARNs de plantas son muy variables en forma y tamaño en comparación con los precursores de miARNs de plantas. Y por lo tanto, poco se sabía sobre el reconocimiento de los precursores por la maquinaria de procesamiento. En la segunda parte de este trabajo presentamos una estrategia para estudiar la conservación de los precursores de miARNs de plantas en distintas especies identificando regiones y dominios presentes en distintas especies. A partir de estos resultados, desarrollamos un herramienta de visualización para poder analizar fácilmente la conservación de la estructura primaria y secundaria de los precursores de miARNs. El análisis las mismas reveló que existe una marcada correlación entre la conservación de los precursores y el mecanismo de procesamiento. Los resultados muestran patrones de onservación en los dominios necesarios para el procesamiento, y permiten deducir un modelo general del reconocimiento del ARN durante la biogénesis de miARNs.Ítem Acceso Abierto Identification of key sequence features required for microRNA biogenesis in plants(Nature Research, 2020-10-21) Rojas, Arantxa María Larisa; Drusin, Salvador Iván; Chorostecki, Uciel Pablo; Mateos, Julieta L.; Moro, Belén; Bologna, Nicolás G.; Bresso, Edgardo Gabriel; Schapire, Arnaldo L.; Rasia, Rodolfo M.; Moreno, Diego M.; Palatnik, Javier F.; http://orcid.org/0000-0003-4316-4518; http://orcid.org/0000-0001-5350-514X; http://orcid.org/0000-0003-2229-6853; http://orcid.org/0000-0002-1156-6662; http://orcid.org/0000-0002-2810-3533; http://orcid.org/0000-0002-2161-7910; http://orcid.org/0000-0002-9798-459X; http://orcid.org/0000-0003-3940-067X; http://orcid.org/0000-0001-5493-8537; http://orcid.org/0000-0001-7996-5224MicroRNAs (miRNAs) are endogenous small RNAs of ∼21 nt that regulate multiple biological pathways in multicellular organisms. They derive from longer transcripts that harbor an imperfect stem-loop structure. In plants, the ribonuclease type III DICER-LIKE1 assisted by accessory proteins cleaves the precursor to release the mature miRNA. Numerous studies highlight the role of the precursor secondary structure during plant miRNA biogenesis; however, little is known about the relevance of the precursor sequence. Here, we analyzed the sequence composition of plant miRNA primary transcripts and found specifically located sequence biases. We show that changes in the identity of specific nucleotides can increase or abolish miRNA biogenesis. Most conspicuously, our analysis revealed that the identity of the nucleotides at unpaired positions of the precursor plays a crucial role during miRNA biogenesis in Arabidopsis.Ítem Embargo Participación de microARNs en el crecimiento y la regeneración de la raíz en Arabidopsis(2022) Baulies, Julia Lidia; Palatnik, Javier F.; Schommer, CarlaLa vida de las plantas vasculares requiere de las funciones de anclaje y absorción que cumple su sistema radicular, el cual, a su vez, depende de la actividad de sus meristemas. En el meristema apical de la raíz (MAR) de la planta modelo Arabidopsis thaliana, una red regulatoria compleja subyace a una anatomía visualmente sencilla por su disposición en filas celulares ordenadas. Además de seguir un programa de desarrollo finamente regulado y sostener un crecimiento continuo durante todo su ciclo de vida, las plantas también deben adaptarse a los estímulos del entorno, que muchas veces pueden ser adversos. Para garantizar la continuidad del crecimiento, existen diversos mecanismos de regeneración que permiten recuperar los meristemas ante eventuales injurias. La remoción del extremo de la raíz, incluyendo al nicho de células madre (NCM), es un sistema modelo para estudiar la regeneración vegetal. Tras dicho evento, las células remanentes atraviesan rápidos cambios de identidad para reorganizarse y reconstruir el NCM perdido. Algunos estudios han comenzado a elucidar los mecanismos que habilitan este proceso; no obstante, hasta el momento, no hay trabajos que aborden el papel de los ARNs pequeños en la reconstrucción del NCM, a pesar de sus prominentes funciones en el desarrollo y la respuesta a los cambios ambientales. Los ARNs pequeños de plantas son moléculas cortas, de entre 20 y 24 nucleótidos de longitud, que participan tanto en la regulación del programa de desarrollo como en la respuesta a estreses bióticos y abióticos, a través de la represión de genes específicos (los targets). Se dividen en dos grandes grupos: los microARNs y los ARNs pequeños de interferencia (siARNs). Mientras que la síntesis de los primeros está mediada por la endonucleasa DICER-LIKE 1 (DCL1), asistida por HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1), la producción de los últimos depende de las acciones parcialmente redundantes de DCL2, DCL3 y DCL4. Impedir la biogénesis de ARNs pequeños resulta en severas anomalías en el desarrollo o la respuesta a diferentes tipos de estrés. Por esta causa, en este trabajo nos abocamos a estudiar el papel de los ARNs pequeños en el crecimiento y la regeneración de la raíz, tanto a nivel de sistemas ARN pequeño-targets específicos como en general. En una primera instancia, evaluamos el rol del sistema miR396 GROWTH-REGULATING FACTORs (GRFs) en las poblaciones celulares del MAR y en la regeneración del NCM. Nuestras observaciones indican que los factores de transcripción GRF son necesarios para sostener en el tiempo la estabilidad del MAR y de los niveles de reguladores maestros en el meristema. Al mismo tiempo, este sistema controla el potencial y la tasa de regeneración: la sobre-expresión de miR396 expande la zona de tolerancia al corte, pero enlentece la regeneración, mientras los GRFs restringen el potencial regenerativo del tejido, pero aceleran la reconstrucción del NCM. Frente a un corte suficientemente cercano al extremo de la raíz, la actividad de los GRFs es necesaria para poder llevar a término la reconstrucción de un NCM organizado, típico de A. thaliana. No obstante, y sorprendentemente, las raíces con bajos niveles de GRFs sostienen el crecimiento indeterminado a pesar de no completar la regeneración, probablemente gracias a una población dispersa de células madre. Luego, analizamos el papel del sistema miR319-TEOSINTE BRANCHED/CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL FACTORs (TCPs), cuyas funciones en el vástago han sido ampliamente estudiadas, en el desarrollo radicular. Impedir la represión de TCP4 por miR319 disminuye la proliferación celular, acortando el MAR y la raíz. Al mismo tiempo, provoca una desorganización del NCM. Por otro lado, la pérdida de función de los TCPs no genera cambios apreciables en este órgano, contrario a lo que se observa en las hojas, demostrando así dos mecanismos de acción diferentes según el contexto: en los vástagos miR319 ejerce una regulación cuantitativa, mientras que en las raíces reprime cualitativamente a sus targets. La función de miR319 parece cobrar mayor relevancia en el crecimiento de la raíz en general, que específicamente en la regeneración. Finalmente, estudiamos la participación general de los ARNs pequeños en el establecimiento del MAR y en la regeneración mediante el uso de líneas mutantes en genes de sus vías de síntesis. Mientras que no hallamos evidencia del requerimiento de los siARNs, los microARNs resultaron ser fundamentales en ambos aspectos. Una severa deficiencia en la producción de microARNs causó distorsiones el NCM, pero permitió sostener el crecimiento continuo. No obstante, frente a la remoción del extremo de la raíz, la regeneración se vio abolida. Aprovechando bases de datos públicas, identificamos diferentes sistemas microARN-targets cuyos balances se alteran tanto por la deficiencia de HYL1 como por el corte del extremo de la raíz. Esto dirigió nuestros esfuerzos a un grupo específico de sistemas a la hora de buscar mecanismos que explicaran, ya fuera total o parcialmente, los defectos observados en las mutantes de biogénesis de microARNs. De esta forma, identificamos nuevas funciones para el sistema miR165/166- HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPERs de clase III, tanto en el desarrollo como en la regeneración de la raízÍtem Acceso Abierto Regulación de la biogénesis de miARNs en Arabidopsis thaliana(2020) Rojas, Arantxa María Larisa; Palatnik, Javier F.Los microARNs (miARNs) son ARNs no codificantes pequeños de entre 20 y 22 nucleótidos que regulan post-transcripcionalmente otros ARNs. La biogénesis de los microARNs comprende la transcripción de un locus endógeno, su procesamiento para dar lugar al microARN maduro y finalmente su asociación con ARGONAUTA para cumplir su función regulatoria. Los precursores de miARN de plantas son diversos en tamaño y forma, y en consecuencia pueden procesarse por diversos mecanismos. A pesar de ello, la mayoría de los precursores contienen un segmento de ARNdh de 15-17 pb entre una región de ARN simple hebra y el sitio donde ocurre el primer corte. Los miARN también están presentes en animales, donde se ha descripto que sus precursores presentan pequeños motivos de secuencia que modulan la eficiencia y precisión con la que son procesados. No se ha estudiado la presencia de este tipo de elementos regulatorios en los precursores de plantas. En esta Tesis se estudió la importancia de secuencia primaria para la biogénesis de los microARNs de plantas. Primeramente, se investigó la identidad de bases a lo largo de los precursores, y en particular en los sitios de corte por DCL1. Encontramos que la región más estructurada de los precursores está formada por aproximadamente un 70% de pares canónicos de Watson-Crick (G-C y A-U), mientras que las combinaciones de bases desapareadas (mismatches) ocurren con diferentes frecuencias. Encontramos que la región cortada por DCL1 presenta una arquitectura particular no solo a nivel de estructura sino a nivel de las bases que lo forman. Estudiamos el efecto de la identidad de las bases durante el procesamiento de miARNs in vivo. En particular encontramos que los mismatches más frecuentes en las estructuras de los precursores son del tipo U-U, A-C y U-C, mientras que otros mismatches se encuentran en baja frecuencia como los C-C y G-G. Un análisis experimental sistemático revelo que los mismatches C-C disminuyen el procesamiento de precursores de miARNs. Este efecto estaría mediado por aumento de flexibilidad en la estructura del precursor ocasionada por el mismatch C-C en particular, la cual termina afectando el procesamiento por DCL1. Luego, estudiamos el precursor del miR172a. Este miARN es importante en la determinación del tiempo de floración y establecimiento del patrón de la flor. Nos enfocamos en las características particulares de este miARN, en busca de información relevante para su biogénesis o actividad. Encontramos que el grado de apareamiento del tallo inferior y del dúplex de miARN/miARN* puede modular su biogénesis. En particular un alto grado de apareamiento del dúplex favorece su procesamiento. Esta característica la observamos también en otros precursores, como el MIR172C, MIR171B y MIR164A. Estos precursores presentan cierto número de mismatches entre el miARN y miARN*, y al cerrarlos la biogénesis de cada miARN aumentó. Por otro lado, el precursor del miR166b presenta un dúplex muy desapareado, y para este miARN en particular, describimos que esta característica es necesaria para su biogénesis, siendo un precursor no-canónico. Finalmente, nuestros experimentos mostraron que un aumento en la acumulación de miARN, no necesariamente implica una mayor actividad. En ese sentido, la asociación de un miARN con una ARGONAUTA es un proceso crucial. El miR172a es un miARN particularmente interesante en este aspecto, ya que presenta un nucleótido 5’ Adenina. Este nucléotido es poco frecuente en el 5’ de los miARNs, siendo Uracilo el más común. Encontramos que la identidad de dicho nucleótido y la presencia de AGO2 son necesarios para la máxima actividad del miR172a.Ítem Acceso Abierto Structural determinants of Arabidopsis thaliana Hyponastic Leaves 1 function in vivo(Public Library of Science, 2014-11-19) Burdisso, Paula; Milia, Fernando; Schapire, Arnaldo L.; Bologna, Nicolás G.; Palatnik, Javier F.; Rasia, Rodolfo M.MicroRNAs have turned out to be important regulators of gene expression. These molecules originate from longer transcripts that are processed by ribonuclease III (RNAse III) enzymes. Dicer proteins are essential RNAse III enzymes that are involved in the generation of microRNAs (miRNAs) and other small RNAs. The correct function of Dicer relies on the participation of accessory dsRNA binding proteins, the exact function of which is not well-understood so far. In plants, the double stranded RNA binding protein Hyponastic Leaves 1 (HYL1) helps Dicer Like protein (DCL1) to achieve an efficient and precise excision of the miRNAs from their primary precursors. Here we dissected the regions of HYL1 that are essential for its function in Arabidopsis thaliana plant model. We generated mutant forms of the protein that retain their structure but affect its RNA-binding properties. The mutant versions of HYL1 were studied both in vitro and in vivo, and we were able to identify essential aminoacids/residues for its activity. Remarkably, mutation and even ablation of one of the purportedly main RNA binding determinants does not give rise to any major disturbances in the function of the protein. We studied the function of the mutant forms in vivo, establishing a direct correlation between affinity for the pri-miRNA precursors and protein activity.