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Examinando por Autor "Ritagliati, Carla"

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    Caracterización de la proteína con bromodominio BDF1 de Trypanosoma cruzi (TcBDF1) y su participación en la acetilación de proteínas glicosomales
    (Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-03-14) Ritagliati, Carla; Serra, Esteban Carlos
    Trypanosoma cruzi es un protozoo flagelado y el agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Tiene un ciclo de vida complejo que alterna entre dos huéspedes y por lo menos tres estadíos de desarrollo diferentes. Actualmente, el tratamiento de la enfermedad de Chagas depende de drogas que son tóxicas para el hospedador y susceptibles a mecanismos de resistencia del parásito. Por lo tanto es necesario encontrar nuevos blancos para determinar alternativas terapeúticas más eficientes. Además, este parásito presenta características únicas que lo hacen un interesante modelo para el estudio de diversos procesos propios de las células eucariotas. La acetilación se ha revelado en los últimos años como una de las modificaciones postranscripcionales más frecuentes, tanto en bacterias como en células eucariotas, de naturaleza conservada y ubicua, lo que sugiere un alto poder regulatorio que lleva a compararla con la fosforilación de proteínas. Esta es una modificación covalente llevada a cabo por enzimas denominadas Lisina Acetiltransferasas y Lisina Deacetilasas. El bromodominio, es el único dominio proteico de unión a lisina acetilada, presente casi exclusivamente en proteínas de localización nuclear. Para entender mejor la acetilación como mecanismo de regulación celular nos propusimos identificar las proteínas acetiladas de T. cruzi, caracterizar el Factor con Bromodominio 1 (TcBDF1) y dos lisina deacetilasas de la familia Sir2 (sirtuinas, TcSIR2RP1 y TcSIR2RP3). En este trabajo se identificaron por primera vez proteínas acetiladas (150) en T. cruzi, distribuídas entre los distintos compartimentos celulares e involucradas en una amplia variedad de funciones. Como era de esperar, el número de proteínas acetiladas en T. cruzi es más cercano al de Toxoplasma y Plasmodium falciparum que al de células de mamíferos o plantas. A pesar de que el número de proteínas acetiladas detectadas depende de la profundidad del análisis, los datos presentados sugieren fuertemente que la acetilación es una modificación crítica encontrada en todos los reinos y que hay una presión selectiva para mantener esta actividad aún después de una adaptación a vida parasitaria. TcBDF1 se expresa en todos los estadíos del ciclo de vida, pero presenta una expresión diferencial, siendo más abundante en el estadío infectivo (tripomastigotes) que en lo replicativos (epimastigotes y amastigotes). En epimastigotes, se concentra en los glicosomas, dirigido por una señal de transporte peroxisomal tipo II (PTS‐2). La sobreexpresión de la proteína salvaje produce epimastigotes con morfología aberrante que casi no se replican, pero los tripomastigotes sobreexpresantes son más infectivos. Por otro lado, la sobreexpresión de la proteína con una doble mutación puntual en el sitio de unión de la lisina acetilada, no es deletérea para el crecimiento de epimastigotes. Los resultados obtenidos nos permiten proponer que TcBDF1 forma parte de un complejo proteico glicosomal que participaría en la regulación de la acetilación de distintas proteínas presentes en esta organela, modulando la actividad metabólica o el importe de proteínas a la misma. Esto significaría que todos los componentes básicos de las vías de señalización por acetilación nucleares también estarían presentes en el citoplasma y en el glicosoma. TcSIR2RP1 es una proteína citoplasmática que presenta una expresión diferencial en los distintos estadíos: es más abundante en los estadíos replicativos que en el infectivo. Su sobreexpresión no afecta el crecimiento de epimastigotes ni su morfología, pero éstos se diferencian más eficientemente a tripomastigotes y resultan más infectivos. TcSIR2RP3 posee una localización mitocondrial y una expresión diferencial a lo largo del ciclo de vida de T. cruzi, es más abundante en epimastigotes que en amastigotes y no se observa en tripomastigotes, al menos en las condiciones ensayadas. TcSIR2RP3 está involucrada en la respuesta al estrés oxidativo. Su sobreexpresión modifica el crecimiento de epimastigotes pero no afecta su morfología ni su tasa de metaciclogénesis. La capacidad infectiva de los tripomastigotes se ve levemente disminuída pero la tasa de duplicación de los amastigotes intracelulares aumentada. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la actividad de las sirtuinas es importante para la proliferación de las formas replicativas, para la interacción huésped‐parásito y para la diferenciación entre los distintos estadíos, pero cada una está involucrada en diferentes procesos. Actualmente, está en auge el desarrollo de inhibidores de deacetilasas por su potencial para el tratamiento de enfermedades infeccionas y no infeccionas. Nuestros resultados contribuyen al conocimiento de la localización y función de estas enzimas y las cepas sobreexpresantes de sirtuinas contruídas en este trabajo pueden ser herramientas utiles para ensayar inhibidores de sirtuinas con fines terapeúticos.
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    Construction of three new Gateway® expression plasmids for Trypanosoma cruzi
    (Instituto Oswaldo Cruz, 2014-12) Alonso, Victoria Lucía; Ritagliati, Carla; Cribb, Pamela; Serra, Esteban Carlos
    We present here three expression plasmids for Trypanosoma cruzi adapted to the Gateway® recombination cloning system. Two of these plasmids were designed to express trypanosomal proteins fused to a double tag for tandem affinity purification (TAPtag). The TAPtag and Gateway® cassette were introduced into an episomal (pTEX) and an integrative (pTREX) plasmid. Both plasmids were assayed by introducing green fluorescent protein (GFP) by recombination and the integrity of the double-tagged protein was determined by western blotting and immunofluorescence microscopy. The third Gateway adapted vector assayed was the inducible pTcINDEX. When tested with GFP, pTcINDEX-GW showed a good response to tetracycline, being less leaky than its precursor (pTcINDEX).
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    Membrane potential assessment by fluorimetry as a predictor tool of human sperm fertilizing capacity
    (Frontiers Media, 2020-01-17) Baró Graf, Carolina; Ritagliati, Carla; Torres Monserrat, Valentina; Stival, Cintia Estefanía; Carizza, Carlos; Buffone, Mariano Gabriel; Krapf, Darío
    Mammalian sperm acquire the ability to fertilize eggs by undergoing a process known as capacitation. Capacitation is triggered as the sperm travels through the female reproductive tract. This process involves specific physiological changes such as rearrangement of the cell plasma membrane, post-translational modifications of certain proteins, and changes in the cellular permeability to ions – with the subsequent impact on the plasma membrane potential (Em). Capacitation-associated Em hyperpolarization has been well studied in mouse sperm, and shown to be both necessary and sufficient to promote the acrosome reaction (AR) and fertilize the egg. However, the relevance of the sperm Em upon capacitation on human fertility has not been thoroughly characterized. Here, we performed an extensive study of the Em change during capacitation in human sperm samples using a potentiometric dye in a fluorimetric assay. Normospermic donors showed significant Em hyperpolarization after capacitation. Em values from capacitated samples correlated significantly with the sperm ability to undergo induced AR, highlighting the role of hyperpolarization in acrosomal responsiveness, and with successful in vitro fertilization (IVF) rates. These results show that Em hyperpolarization could be an indicator of human sperm fertilizing capacity, setting the basis for the use of Em values as a robust predictor of the success rate of IVF.
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    Overexpression of bromodomain factor 3 in Trypanosoma cruzi (TcBDF3) affects differentiation of the parasite and protects it against bromodomain inhibitors
    (Wiley, 2016-06-06) Alonso, Victoria Lucía; Ritagliati, Carla; Cribb, Pamela; Cricco, Julia Alejandra; Serra, Esteban Carlos; Glaxo Smith Kline (GSK): provide I-BET151
    The bromodomain is the only protein domain known to bind acetylated lysine. In the last few years many bromodomain inhibitors have been developed in order to treat diseases such as cancer caused by aberrant acetylation of lysine residues. We have previously characterized Trypanosoma cruzi bromodomain factor 3 (TcBDF3), a bromodomain with an atypical localization that binds acetylated α-tubulin. In the present work we show that parasites overexpressing TcBDF3 exhibit altered differentiation patterns and are less susceptible to treatment with bromodomain inhibitors. We also demonstrate that recombinant TcBDF3 is able to bind to these inhibitors in vitro in a concentration-dependant manner. In parallel, the overexpression of a mutated version of TcBDF3 negatively affects growth of epimastigotes. Recent results, including the ones presented here, suggest that bromodomain inhibitors can be conceived as a new type of anti-parasitic drug against trypanosomiasis.
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    Overexpression of cytoplasmic TcSIR2RP1 and mitochondrial TcSIR2RP3 impacts on Trypanosoma cruzi growth and cell invasion
    (Public Library of Science (PLOS), 2015-04-15) Ritagliati, Carla; Alonso, Victoria Lucía; Manarin, Romina; Cribb, Pamela; Serra, Esteban Carlos
    Abstract Background Trypanosoma cruzi is a protozoan pathogen responsible for Chagas disease. Current therapies are inadequate because of their severe host toxicity and numerous side effects. The identification of new biotargets is essential for the development of more efficient therapeutic alternatives. Inhibition of sirtuins from Trypanosoma brucei and Leishmania ssp. Showed promising results, indicating that these enzymes may be considered as targets for drug discovery in parasite infection. Here, we report the first characterization of the two sirtuins present in T. cruzi. Methodology Dm28c epimastigotes that inducibly overexpress TcSIR2RP1 and TcSIR2RP3 were constructed and used to determine their localizations and functions. These transfected lines were tested regarding their acetylation levels, proliferation and metacyclogenesis rate, viability when treated with sirtuin inhibitors and in vitro infectivity. Conclusion TcSIR2RP1 and TcSIR2RP3 are cytosolic and mitochondrial proteins respectively. Our data suggest that sirtuin activity is important for the proliferation of T. cruzi replicative forms, for the host cell-parasite interplay, and for differentiation among life-cycle stages; but each one performs different roles in most of these processes. Our results increase the knowledge on the localization and function of these enzymes, and the overexpressing T. cruzi strains we obtained can be useful tools for experimental screening of trypanosomatid sirtuin inhibitors.