Examinando por Autor "Rodríguez, Eduardo José"
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Ítem Embargo Aplicaciones biotecnológicas de bacterias del género Streptomyces(2022) Bercovich, Bárbara Aylén; Rodríguez, Eduardo JoséEl género Streptomyces se encuentra ampliamente distribuido a través de ecosistemas terrestres y acuáticos, como saprófitos de vida libre como así también formando simbiosis con organismos eucariotas superiores. Esta diversidad ecológica se refleja en su potencial metabólico, ya que las actinobacterias son productores extremadamente versátiles de compuestos naturales con diferentes actividades de suma importancia para la salud humana, la agricultura y la industria biotecnológica. Es por eso, que en este trabajo nos propusimos caracterizar diferentes cepas de Streptomyces, y sus metabolitos bioactivos, con el fin de hallar y/o optimizar potenciales aplicaciones biotecnológicas de las mismas. En el primer capítulo de esta tesis, realizamos una búsqueda bioguiada partir de sobrenadantes de cultivos de actinobacterias que repriman la actividad del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ de Salmonella enterica serovar typhimurium. Este patógeno oportunista infecta múltiples hospedadores y causa gastroenteritis, siendo la causa más prevalente de enfermedades transmitidas por los alimentos en todo el mundo. Ante la rápida propagación de la resistencia a los antibióticos que la combaten, existe la necesidad de encontrar compuestos con mecanismos y modos de acción alternativos. El SDC PhoP/PhoQ de S. typhimurium controla la expresión de los genes no esenciales que le permiten a este patógeno internalizarse, sobrevivir y multiplicarse dentro de las células huésped. El hecho de que homólogos al SDC estén ausentes en mamíferos, han colocado a dicho sistema como objetivo clave en la búsqueda de compuestos con efecto de anti- virulencia. Mediante el uso de cepas reporteras de genes dependientes de SDC PhoP/PhoQ en un principio se obtuvieron al menos 7 sobrenadantes de actinobacterias que reprimían la actividad transcripcional de genes controlados por el PhoP. Luego, estudios con diferentes cepas reporteras permitieron seleccionar el sobrenadante de la cepa Streptomyces eurocidicus e identificarla azomicina como el compuesto bioactivo, responsable de la capacidad inhibitoria del SDC PhoP/PhoQ. Mediante estudios transcripcionales en diferentes cepas reporteras y mutantes se pudo determinar que dicho metabolito actúa de manera reversible y específica, a través de dos posibles mecanismos: uno, generando un estado periplasmático oxidante e involucrando a MgrB como inhibidora de la proteína sensora PhoQ; y otro, actuando directamente o indirectamente sobre PhoP, reprimiendo su capacidad como regulador de respuesta, de una manera independiente de PhoQ. Por otro lado, estudios celulares con cultivos de macrófagos RAW264.7 en presencia de azomicina mostrsaron la efectividad de este compuesto para inhibir la replicación intravacuolar de Salmonella dentro de estas células fagocíticas. Frenar este paso es indispensable para evitar la dispersión del patógeno bacteriano y alcanzar órganos vitales provocando infecciones sistémicas. Estos resultados reposicionan a la azomicina secretada por S. eurocidicus para diseñar una nueva terapia que trate las infecciones por Salmonella. Por otro lado, se ha demostrado que el género Streptomyces interacciona con organismos eucariotas superiores como es el caso de las plantas, formando parte de su rizósfera o endofíticamente. Esta interacción, puede promover y proteger su desarrollo a través de compuestos antimicrobianos (antibióticos, antifúngicos, insecticidas y/o antihelmínticos), hormonas vegetales, sideróforos que ayudan en la captación de Fe o facilitando la solubilización de fosfato, entre otras. El contacto de las bacterias con las plantas también puede proporcionar protección a las mismas a través de la activación de las vías de resistencia, induciéndole una capacidad defensiva mejorada frente a próximos ataques de patógenos. En este sentido, en el segundo capítulo analizamos las cepas Streptomyces eurocidicus y Streptomyces filipinensis, y sus productos naturales, como promotoras de crecimiento de plantas de soja (Glycine max (L.) Merr.) y como protectoras frente a diferentes hongos fitopatógenos que afectan dicho cultivo vegetal. Buscando ser una alternativa ecológica y superadora a los antifúngicos químicos comerciales utilizados, que resultan dañinos para el medio ambiente y para la salud. En este trabajo pudimos demostrar in vitro la producción de AIA y de sideróforos y la capacidad de solubilizar fosfato por parte de S. eurocidicus y S. filipinensis que pueden contribuir en el crecimiento y desarrollo de las plantas de soja. A su vez, determinamos que el agregado de estas cepas de Streptomyces genera efectos positivos en la germinación, emergencia y la nodulación primaria en maceta. Por otro lado, pudimos corroborar la promoción del crecimiento y desarrollo del cultivo de soja en invernadero, en estado vegetativo y reproductivo; que se vio traducido tanto en un incremento en el rendimiento del grano con respecto a las plantas sin tratar y a aquellas pre-tratadas con el antifúngico comercial, como en una mejora transgeneracional en la germinación y estado sanitario de las semillas obtenidas en la madurez de las plantas de soja pre-tratadas con S. eurocidicus. Asimismo, también se demostró la actividad antifúngica in vitro de los polienos eurocidina y filipina producidos por S. eurocidicus y S. filipinensis, respectivamente, frente a los patógenos fúngicos M. phaseolina, D. phaseolorum, F. tucumaniae, F. verticillioides, R. solani y C. graminícola. Luego se determino la protección de los cultivos de soja en tres patosistemas diferentesde las enfermedades de Podredumbre Carbonosa, Cancro de Tallo y Síndrome de Muerte Súbita. En todos los casos se obtuvo una reducción significativa de síntomas de dichas enfermedades al tratar las semillas con S. eurocidicus o S. filipinensis en comparación con los obtenidos para los tratamientos con la mezcla de antifúngicos comerciales utilizados como referencia o los controles sin tratar. Curiosamente, en estos ensayos de biocontrol se obtuvo la misma protección con el tratamiento de las cepas salvajes que con las cepas mutantes no productoras de los polienos. Por tanto, estos resultados sugieren que podrían estar implicados otros mecanismos más allá de la producción del compuesto antifúngico poliénico. Teniendo en cuenta la separación espacial y temporal de los tratamientos de Streptomyces y la infección por patógenos dada en el sistema soja-D. phaseolorum, este efecto de protección podría explicarse a través de un mecanismo de resistencia sistémica inducida en las plantas, aunque esta hipótesis debe ser confirmada. En conjunto, estos resultados sugieren que la promoción y el biocontrol ejercido por S. eurocidicus y S. filipinensis reducirían las pérdidas en cantidad y calidad de semillas por infecciones fúngicas en el cultivo de soja. Por tanto, la aplicación de este tratamiento ecológico y sustentable, podría ser una alternativa en el manejo de control integrado contra diversos patógenos. Si bien estos resultados, no pudieron replicarse por completo en el ensayo a campo realizado, queda pendiente la reiteración en otras campañas, región/es y/o con otra/s línea/s de semillas de soja.Ítem Embargo Estudio de acetil-CoA carboxilasas de tipo eucariota de Actinobacterias(2021) Livieri, Andrea L.; Rodríguez, Eduardo JoséLas acetil-CoA carboxilasas (ACC) son enzimas que catalizan la carboxilación de acetil-CoA para dar malonil-CoA, un metabolito esencial en diversos procesos metabólicos como la síntesis de novo de ácidos grasos. Este tipo de complejos está compuesto por tres dominios funcionalmente diferentes. Hasta el momento, los complejos ACC caracterizados de procariotas y plastidios de la mayoría de las plantas, poseen estos dominios codificados en diferentes subunidades formando complejos heteroméricos. Por el contrario, los dominios de los complejos ACC de eucariotas y plastidios de gramíneas, están codificados en una única cadena polipeptídica formando complejos homoméricos. En el presente trabajo de tesis, nos propusimos caracterizar los complejos ACC de dos Actinobacterias importantes desde el punto de vista biotecnológico, Saccharopolyspora erythraea y Rhodococcus jostii. Mediante estudios bioinformáticos se identificó que tanto el genoma de S. erythraea como el de R. jostii contenían genes que codificaban para proteínas con alta similitud de secuencia a las ACC de eucariotas, SACE_4237 y RO_04222, respectivamente. Por otra parte, en el genoma de R. jostii se encontró otro gen que codificaría para una proteína, RO_01202, con alta similitud de secuencia a AccD6 de Mycobacterium tuberculosis. Estudios bioquímicos con SACE_4237 de S. erythraea permitieron determinar que esta proteína forma un complejo homodimérico con actividad carboxilasa frente a acetil-CoA y propionil-CoA in vitro. Mientras que los estudios fisiológicos y genéticos determinaron que esta proteína era esencial para el crecimiento de S. erythraea, siendo fundamental en generar el malonil-CoA para la síntesis de ácidos grasos. Por otro lado, también se determinó que en medios en base a carbohidratos estaría involucrada en proveer precursores para la síntesis de eritromicina A. Para el caso de R. jostii, se encontró que RO_01202 es esencial para el crecimiento solo en medios mínimos con baja concentración de nitrógeno, aunque hasta aquí no se pudo establecer la razón fisiológica de esta esencialidad. Por otra parte, se demostró que RO_04222 no es esencial en los medios ensayados, pero si es una proteína fundamental para la síntesis y acumulación de ácidos grasos y triacilglicéridos. Así, en este trabajo de tesis, se logró determinar que existen complejos homodiméricos con actividad ACC presentes en Actinobacterias y que este tipo de complejos no son solo característicos de eucariotas como se pensaba hasta el momento, lo que permite pensar un nuevo planteo evolutivo sobre el origen de estas proteínas y las presentes en eucariotas.Ítem Acceso Abierto Metabolismo de la alantoína en Streptomyces coelicolor : relación entre metabolismo primario y secundario(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-03-10) Navone, Laura; Rodríguez, Eduardo José; Gramajo, Hugo CesarLas purinas y derivados como la alantoína son componentes abundantes del suelo, constituyendo una fuente de carbono y nitrógeno muy importante del hábitat natural de Streptomyces. En este trabajo de tesis se caracterizó la vía metabólica de degradación de alantoína como así también la regulación de la misma en S. coelicolor, mediante técnicas proteómicas, metabolómicas, bioquímicas, de biología molecular y de ingeniería genética. A partir de experimentos de proteómica se identificaron la mayor parte de las proteínas involucradas en la degradación de alantoína en esta bacteria. Posteriormente, se caracterizaron cuatro enzimas de esta vía, alantoinasa y alantoicasa, las cuales son esenciales para el crecimiento de la bacteria en medio con alantoína, e hidroxipiruvato isomerasa y tartronato semialdehído reductasa mediante técnicas bioquímicas y de ingeniería genética. Por otra parte, se identificó el regulador transcripcional negativo AllR del metabolismo de la alantoína en S. coelicolor. Ensayos in vitro permitieron identificar los sitios de unión de este regulador a tres promotores de la vía. Estos sitios se encuentran altamente conservados en otras especies de Streptomyces lo que denota una preservación en la regulación de esta ruta metabólica en este importante género bacteriano. Estos estudios permitieron proponer un modelo de regulación mediado por alantoato. A su vez, este trabajo permitió realizar una conexión importante entre el metabolismo primario de alantoína y el metabolismo secundario de producción de antibióticos en S. coelicolor. Por un lado, se evidenció que la degradación de alantoína provoca una marcada disminución de la producción de antibióticos. Mediante técnicas de metabolómica y análisis de compuestos nitrogenados en los cultivos se pudo determinar que el producto final de esta vía es amonio. El aislamiento de una mutante en el complejo ureasa, que no genera acumulación de amonio extracelular pero es capaz de producir niveles normales de antibióticos en medio con alantoína, permitió conectar el exceso de amonio con la inhibición de la producción de antibióticos durante el metabolismo de alantoína. Por otro lado, se estableció que el normal funcionamiento del regulador AllR es necesario para la producción de antibióticos en S. coelicolor, ya que la inactivación del gen allR afecta notablemente la síntesis de los mismos. La inactivación de genes que aumentan su expresión en ausencia del regulador AllR permitió identificar al gen hyi, que codifica para la enzima hidroxipiruvato isomerasa, como responsable de este efecto. La mutante AllR-Hyi- revierte la producción de metabolitos secundarios a los niveles de la cepa parental. Para agregar a esto, una mutación en el gen hyi en la cepa parental provoca un aumento de la síntesis de antibióticos y abre una puerta para estudios futuros como estrategia para aumentar la producción de compuestos bioactivos en esta especie bacteriana. Este trabajo expresa la importancia del estudio de las vías metabólicas primarias, no solo para aumentar el conocimiento general de este importante género bacteriano sino también debido a la interacción de estas vías con el metabolismo secundario y la posibilidad de una futura manipulación para beneficio del ser humano.