Evaluación preclínica de la eficacia de una vacuna a subunidades recombinante contra T. cruzi administrada a nivel de mucosas

La ECh es una patología endémica en América Latina, descripta en el año 1909 por el médico brasileño Carlos Chagas. Desde su descubrimiento, se han evaluado distintas estrategias vacunales que han abarcado desde parásitos muertos, atenuados, homogenados, proteínas purificadas, recombinantes, hasta vacunas a ácidos nucleicos y diversos sistemas de delivery. En general, las vías de administración más utilizadas han sido las parenterales, mientras que las vías mucosales han sido evaluadas en menor medida. Independientemente del antígeno, adyuvante y vía de administración utilizada, hasta el momento, los estudios preclínicos han arrojado resultados parcialmente satisfactorios, en términos de control de la parasitemia y prevención del daño tisular crónico. En parte, esto se debe a que en un inicio el diseño de la vacuna se enfocaba principalmente en el desarrollo de anticuerpos neutralizantes, los cuales, a pesar de ser muy efectivos, solo eliminaban las formas circulantes de los parásitos. Las evidencias disponibles del rol fundamental que juegan los linfocitos T en la contención de la infección, hace que las nuevas estrategias vacunales intenten estimular también esta rama de la respuesta inmune adaptativa. Por otra parte, estudios más recientes han mostrado que la inducción de una respuesta inmunogénica a nivel de mucosas es capaz de generar paralelamente una respuesta sistémica, mientras que lo contrario no siempre ocurre. La superfamilia de proteínas Transialidasa (TS) comprende ocho subgrupos. Las del Grupo I (TS-GI) han sido utilizadas en distintas estrategias vacunales experimentales con resultados alentadores. Sin embargo, estos estudios no son siempre comparables en términos de antigenicidad, inmunogenicidad y eficacia, debido al uso de diferentes TS-GI o sus fragmentos, la administración por diferentes vías, su formulación con distintos adyuvantes y/o el uso de distintas cepas murinas. Teniendo en cuenta que T. cruzi infecta fundamentalmente a través de piel o de mucosas, y que una respuesta inmunogénica a este nivel otorgaría protección local y sistémica, en la primera etapa de este trabajo se propuso evaluar la inmunogenicidad y eficacia protectora de distintas formulaciones vacunales mucosales que contenían distintos fragmentos recombinantes derivados de las TS-GI y el adyuvante mucosal di-AMP-c. En los Capítulos 1 y 2 se presentan los resultados del análisis de la inmunogenicidad y eficacia protectora de dos TS-GI recombinantes que carecen del dominio SAPA (denominadas C-terminal y N-terminal) y adyuvadas con di-AMP-c. Ambas formulaciones vacunales, administradas por vía intranasal, indujeron niveles elevados de anticuerpos específicos en plasma y mucosas y una respuesta celular mediada por linfocitos T e IFN-ℽ. Incluso mostraron buena eficacia protectora tras el desafío oral con T. cruzi, ya que lograron controlar la parasitemia y atenuar el daño tisular agudo. En el caso de la formulación que contenía el fragmento N-terminal, también atenuó la miocarditis crónica y disminuyó la frecuencia de alteraciones electrocardiográficas. Como una estrategia tendiente a incrementar el número de epitopos T y B presentes en el inmunógeno, también se empleó una formulación que contenía los dos fragmentos recombinantes mencionados anteriormente, adyuvados por di-AMP-c (Capítulo 3). Los ensayos de inmunogenicidad, mostraron que se requieren 3 dosis para generar una respuesta sistémica de anticuerpos específicos, mientras que con 2 dosis ya puede apreciarse la secreción de IgA (ya que el esquema de 3 dosis se había realizado de modo empírico y en base a modelos pre-clínicos similares). Por otra parte, verificamos el desarrollo de una respuesta T-específica con producción de IFN-γ en los linfocitos del NALT. También mostramos por primera vez, que la administración de TS+di-AMP-c promueve a nivel del NALT un perfil mixto de citocinas Th1/Th17/Th2. En una segunda etapa de la tesis se analizaron distintos aspectos de la variabilidad antigénica de las TS-GI. Sorprendentemente, la antigenicidad de las TS-GI entre los linajes de parásitos y su influencia en el desarrollo de vacunas no se ha analizado en profundidad. Mediante evaluaciones in silico se demostró que las secuencias reportadas comparten una identidad del 92 %, y además, que las regiones antigénicas T y B se conservan en la mayoría de las secuencias de las TS-GI o bien presentan sustituciones de aminoácidos que apenas pueden alterar la antigenicidad. Teniendo en cuenta que las TS-GI muestran una alta homología de secuencia entre especies, estos resultados asimismo indican que la utilización de una TS proveniente de una especie en particular, tiene altas chances de inducir una respuesta protectora adecuada contra cepas de otras especies. En la literatura sobre vacunas se suele utilizar el término "Transialidasa" para referirse a diferentes proteínas de esta amplia superfamilia, aún cuando estos antígenos pueden pertenecer a diferentes subgrupos. Esto genera un cierto grado de confusión, dado que en muchos casos estas TS-GI comparten una identidad de secuencia baja o nula. Por este motivo, se realizó un análisis in silico adicional de los fragmentos de TS-GI probados en las vacunas experimentales para determinar su grado de cobertura e identidad. Los resultados indicaron que la identidad de las secuencias vacunales es alta, pero la cobertura de los segmentos utilizados varía ampliamente. En consecuencia, esto señaló que los epítopos T restringidos por MHC-I y II, y los epítopos B están representados de manera diferente entre las vacunas. También se llevaron a cabo predicciones de cobertura poblacional. Curiosamente, las predicciones con respecto a la cobertura poblacional mundial y de América del Sur estimadas en las secuencias indexadas y en las vacunas es elevada. Las predicciones incluso indican que varios epítopos T fuertes son compartidos por supertipos HLA-I humanos y haplotipos H-2K murinos, lo que sugiere que debido a su potencial inmunogénico podrían utilizarse para mejorar y facilitar el desarrollo de nuevas vacunas basadas en TS-GI. Para fortalecer tales hallazgos, se realizaron predicciones de acoplamiento molecular que comprobaron que una fuerza de unión similar de tales epítopos entre supertipos HLA-I y haplotipos H-2K. En base a estos resultados se plantean diferentes estrategias que cubrirán más o eventualmente completamente estos epítopos T y B para alcanzar un alto nivel de cobertura poblacional. En conclusión, este trabajo de tesis proporciona nuevos datos sobre el potencial inmunogénico y antigénico de las TS-GI como candidatos vacunales.

Tesis Doctoral Ciencias Biomédicas - Evaluación Preclínica