Caracterización del mecanismo responsable de la resistencia a HALOXIFOP-P-METIL y Glifosato en Sorghum halepense

Los herbicidas son una importante herramienta en la producción agrícola para controlar malezas, evitar la erosión del suelo y mantener altos rendimientos. En Argentina, el modelo agro-productivo consolidado en las últimas décadas se basa en el cultivo de soja transgénica tolerante a glifosato (ya sea en monocultivo, o bien, en una rotación con maíz transgénico tolerante al mismo herbicida). Sin embargo, la elevada eficacia combinada con la simplicidad de operación de estos sistemas resultó en el uso excesivo de un pequeño número de herbicidas. Esto trajo como consecuencia inmediata una disminución en la diversidad productiva, una reducción sustancial en la abundancia de numerosas especies de malezas y la evolución de biotipos resistentes. El primer caso de resistencia a herbicidas en Argentina fue detectado en 1996, y al día de la fecha existen 18 especies diferentes que han desarrollado resistencia al menos a un herbicida, ascendiendo este número a 262 especies a nivel mundial. Así, la resistencia a herbicidas en malezas representa hoy uno de los problemas más importantes que enfrentan los sistemas agropecuarios en todo el mundo. El sorgo de Alepo (Sorghum halepense (L.) Persoon) ha sido introducido al país con propósitos forrajeros, pero actualmente es considerada una de las malezas más problemáticas del mundo, causando grandes pérdidas económicas. Es una gramínea C4, perenne y alotetraploide. Sus características la vuelven una especie sumamente competitiva, interfiriendo con los barbechos previos a cultivos primavero-estivales como soja, maíz o girasol. El principal inconveniente que presenta para su control químico eficaz y económico es su carácter de perennidad a través de la formación de rizomas de gran extensión y biomasa, especialmente en condiciones de ausencia de labranza. Este atributo es el que dificulta marcadamente el control mediante tratamientos con herbicidas sistémicos post-emergentes. En este trabajo de tesis se caracterizó la resistencia múltiple a herbicidas inhibidores de la ACCasa y a glifosato de una subpoblación de Sorghum halepense hallada en campos de Gobernador Crespo (GC-R). Los ensayos in vivo con haloxifop-p-metil mostraron que la subpoblación GC-R es altamente resistente con valores de LD50 y GR50 mayores a ocho veces la dosis recomendada a campo. Experimentos de dosis respuesta sobre ciertos individuos seleccionados de esta subpoblación (GC-C4, GC-C6 y GC-C7) permitieron explicar la resistencia observada y justificar los valores de GR50 y LD50 de la subpoblación original. A su vez, los estudios XI moleculares de secuencias nucleotídicas permitieron identificar dos mutaciones en el gen de la ACCasa. Las sustituciones provocadas por estos cambios (I2041N y A2096G) fueron reportadas previamente como responsables de conferir altos niveles de resistencia a varios principios activos de herbicidas del grupo A. Además, se encontró una sustitución no reportada (IXXXXT) sobre el dominio CT de la ACCasa, exclusiva de la subpoblación en estudio, que podría estar implicada en el fenotipo de resistencia. La identificación de nuevos alelos que confieren resistencia resulta de gran interés por su potencial aplicación en el desarrollo de cultivos tolerantes a herbicidas. Por otra parte, los estudios de qPCR realizados indicaron la ausencia de un mecanismo de amplificación génica. Además, no se encontraron evidencias para postular a un mecanismo de resistencia metabólica contribuyendo de manera significativa a la resistencia. Por consiguiente, los resultados obtenidos confirman que la resistencia a haloxifopp-metil de la subpoblación GC-R se debe principalmente a un mecanismo asociado al sitio de acción. Con respecto al glifosato, los estudios de dosis respuesta confirmaron la resistencia de la subpoblación GC-R con un valor de LD50 poco mayor a la dosis recomendada a campo. Sin embargo, la biomasa remanente se vio severamente afectada a dicha dosis. Los estudios moleculares permitieron descartar un mecanismo asociado al sitio de acción (mutaciones en la secuencia y amplificación del gen EPSPS), de acuerdo con lo reportado previamente para esta maleza. La profunda caracterización de los mecanismos de resistencia en la subpoblación GCR, derivó en el desarrollo y optimización de una PCR cuantitativa alelo específica (ASqPCR) que posibilita la identificación rápida y confiable de la relación de alelos mutados respecto a los alelos salvajes en individuos de una especie poliploide con múltiples copias del gen bajo estudio. Finalmente, se logró expresar de manera recombinante y obtener en fase soluble el dominio CT de la ACCasa de Sorghum halepense. La obtención de las distintas versiones alélicas del dominio CT recombinante abre las puertas para su caracterización funcional en presencia de inhibidores y para la exploración de nuevas sustituciones implicadas en la resistencia. Así, la optimización de esta herramienta de análisis representa una estrategia prometedora a fin de evaluar alelos novedosos que puedan encontrarse en poblaciones naturalmente resistentes.