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Recent Submissions
Remediación de aguas contaminadas con molibdatos, empleando algas pardas como biosorbente
(2023) Carnevale, Betina; Bertoni, Fernando A.
El acceso al agua potable segura es uno de los desafíos más importantes a los que nos
enfrentamos en la actualidad. El agua desempeña un papel crucial en la salud pública, el
crecimiento económico y la sostenibilidad del medio ambiente. La ocurrencia natural de
altas concentraciones de molibdeno en aguas subterráneas y la potencial generación de
descargas al ambiente por la industria, hacen que resulte esencial encontrar métodos
para removerlo. La biosorción ofrece una alternativa a las técnicas convencionales dado
su bajo costo, sustentabilidad y simplicidad. Específicamente, las algas pardas, utilizadas
como biomasa muerta, son un sorbente atractivo por su falta de valor económico y su
elevado contenido de polímeros con potencial capacidad de retener oxoaniones.
La participación de los grupos carboxilo e hidroxilo del adsorbente en la retención de
molibdeno fue confirmada por análisis FT-IR. Las imágenes MEB mostraron
modificaciones en la forma de la superficie del biosorbente post-adsorción.
Se realizaron estudios en lote y en sistemas continuos. El mecanismo seguiría una
cinética de pseudo-segundo orden, con una unión en dos pasos: atracción electrostática
y unión química. Mediante el ajuste utilizando la ecuación de Langmuir, se observó una
capacidad de adsorción de 1376 ± 2 mg.g-1 a 20 °C y pH= 1.0. Los datos de adsorción en
continuo ajustaron mejor con el modelo Dosis-Respuesta modificado. Aplicando el
modelo BDST se evaluó el comportamiento de la columna. La altura de lecho crítica fue
1.7 cm.
Participación de AKAP350 en la sinapsis inmune en células Natural Killer
(2022) Pariani, Alejandro Pedro; Larocca, María Cecilia
Las células Natural Killer (NK) son células efectoras del sistema inmune innato que
poseen la capacidad de eliminar células infectadas con virus y células tumorales. La
citotoxicidad de las células NK requiere una remodelación extensa del citoesqueleto
y una reorganización de los receptores de membrana en la sinapsis inmune (SI)
establecida entre las células NK y las células blanco. Uno de estos receptores es la
integrina αLβ2 (CD11a/CD18) o Leucocyte function associated antigen (LFA)-1, la
cual es esencial para la formación y maduración de la SI. Al unirse a su ligando
ICAM-1, LFA-1 no sólo actúa como una molécula de adhesión que permite una
unión más fuerte con la célula blanco, sino que también transmite señales
tempranas que promueven la activación de la célula NK. Los mecanismos por los
cuales LFA-1 se acumula y organiza en el sitio de sinapsis en estas células no han
sido totalmente clarificados hasta el momento.
AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejos
proteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi (AG). AKAP350 está implicada
en procesos de generación de asimetría celular, a través de su capacidad de facilitar
la transmisión de señales, como así también a través de su rol en la regulación de la
dinámica de los microtúbulos. Respecto a su función en los linfocitos, la proteína
AKAP350 es necesaria para la activación de LFA-1 en células T, asociada tanto a
procesos de migración, como a la activación por reconocimiento de un antígeno. Los
mecanismos involucrados aún no fueron determinados.
En esta Tesis se analizó la participación de AKAP350 en los mecanismos
involucrados en la actividad citotóxica y formación de la SI citolítica en células
Natural Killer. Para esto utilizamos un sistema lentiviral de expresión de shRNA específicos para disminuir la expresión de AKAP350 (AKAP350KD) en una línea
celular derivada de NK humanas, YTS, y en células NK aisladas de sangre periférica
humana. Nuestros resultados mostraron que la disminución de la expresión de
AKAP350 inhibió la capacidad efectora lítica de las células YTS. Esto se
correlacionó con una alteración en la polarización del centrosoma y los gránulos
líticos al sitio de sinapsis, y con un descenso en la acumulación de LFA-1 en la SI en
células AKAP350KD, tanto al ser activadas por una célula blanco, como al ser
activadas selectivamente a través de LFA-1. En experimentos realizados en células
YTS y en cultivos ex vivo de células NK, se observó la presencia de un pool
intracelular de vesículas que contienen LFA-1, asociadas parcialmente al AG, que
polarizó hacía la SI mediante un mecanismo dependiente de AKAP350. Nuestros
resultados demostraron que, así como sucede en células no inmunes, AKAP350
participa en la nucleación de microtúbulos en el AG. La disrupción del AG o la
alteración de la dinámica de microtúbulos afectó la organización de LFA-1 en la SI.
Este efecto también se observó cuando AKAP350 fue desplazada del AG en células
YTS. Por lo tanto, el presente trabajo caracteriza la participación de AKAP350 en la
actividad citotóxica de las células NK y revela un nuevo mecanismo mediante el cual
el AG y, específicamente, la AKAP350 asociada al mismo, facilita el tráfico
intracelular de LFA-1, el cual es de suma relevancia para la organización de LFA-1
en el sitio de sinapsis.
Determinación del mecanismo de acción de los endocannabinoides en Caenorhabditis elegans
(2023) Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Binolfi, Andrés
El colesterol es un lípido esencial constituyente de las membranas de las
células eucariotas. Su función principal es estructural pero también lleva
a cabo funciones como molécula de señalización. Por ello, la regulación
del metabolismo colesterol es crucial para el normal funcionamiento de
las células. En el nematodo Caernohabditis elegans (C. elegans), existe un
grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas
ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la
regulación del desarrollo. En los últimos años, se ha propuesto que un
conjunto de lípidos denominados N-aciletanolaminas (NAEs),
antagonizan la detención del desarrollo de los nematodos [1]. Más
recientemente, nuestro grupo de laboratorio demostró que otra clase de
lípidos, los endocannabinoides (eCBs), regulan el ciclo de vida de C.
elegans mediante la promoción de la movilización de colesterol [2]. Sin
embargo, el mecanismo y las vías de señalización activadas por los eCBs
para movilizar colesterol no son conocidas. Adicionalmente, numerosos
trabajos sugieren un rol directo de los ácidos grasos poliinsaturados
(PUFAs) en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas [3] y
cardiovasculares [4], sugiriendo que algunos ácidos grasos (AGs) regulan
el desarrollo de diversas enfermedades. A pesar de que se ha avanzado
mucho en el entendimiento del rol que juegan los lípidos para el
mantenimiento de la homeostasis celular, su funcionalidad como
moléculas de señalización esta superficialmente estudiada. Por este
motivo, en este trabajo de tesis tratamos de elucidar como los eCBs
actúan como moléculas de señalización promoviendo el transporte del
colesterol en C. elegans. Pudimos identificar diferentes proteínas
involucradas en la vía de señalización activada por 2-O-araquidonoil
glicerol (2-AG), eCB derivado de ácido araquidónico (20:4 ω-6) [5], que
estimula el transporte de colesterol. Nuestros experimentos sugieren que
el 2-AG estimula la movilización de colesterol por un mecanismo
dependiente de los receptores del tipo TRPV (de sus siglas en inglés:
Transient Receptor Potential Vainoillid), la liberación de vesículas de
núcleo denso como también de la vía de señalización de la insulina
Por otra parte, desarrollamos metodologías de Resonancia Magnética
Nuclear (RMN) como metodología para el estudio del metabolismo de AGs
in vivo en C. elegans. Este procedimiento nos permitió estudiar cómo se
modifican los AGs y otros metabolitos en diferentes cepas mutantes y así
identificar nuevos componentes involucrados en la vía de señalización desencadenada por el ortólogo a los receptores de adiponectina (AdipoR1
y AdipoR2), PAQR-2, en condiciones de baja temperatura [6–8].
Estos descubrimientos demuestran, por un lado, de forma precisa que
vías de señalización son activadas por 2-AG en la regulación del tráfico de
colesterol y, por el otro, aportan, claridad para el estudio del rol de los
AGs como moléculas de señalización.
Variantes genéticas en secuencias formadoras de cuádruplex de guanina: consecuencias sobre la expresión de genes asociados a patologías humanas
(2023) Piga, Ernesto José; Armas, Pablo
Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras no canónicas de los ácidos
nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos
como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos
nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. En particular, existe gran
cantidad de evidencia sobre la regulación de genes asociados al desarrollo de patologías
humanas mediada por G4, principalmente de proto-oncogenes. Hasta el inicio de este
trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de las variantes
genéticas presentes en las secuencias con capacidad de formar G4 (sG4), y el efecto que
las mismas generaban sobre los G4. Por este motivo decidimos investigar si las SNV (de
las siglas del término en inglés single nucleotide variants) presentes en los G4 podrían
contribuir a la expresión génica diferencial entre individuos que pueda conducir a la
predisposición o al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esto se realizó una
búsqueda y selección bioinformática de SNV en secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4)
localizadas en regiones reguladoras de la transcripción de genes asociados con
patologías humanas. Realizamos una búsqueda bibliográfica orientada en dos ejes. El
primero fue buscar SNV-sG4 asociadas a variaciones transcripcionales reportadas en la
literatura, y el segundo eje se enfocó en la búsqueda de sG4 en regiones promotoras
proximales y con funciones en la regulación de la transcripción de proto-oncogenes
reportados en la bibliografía y la posterior identificación de SNV presentes en esas sG4.
Los resultados de la búsqueda rindieron 14 genes con 88 SNV-sG4 presentes en ellos.
Luego se analizaron las secuencias de las sG4 utilizando predictores bioinformáticos de
G4 para comparar y seleccionar 43 SNV-sG4 de 14 genes que podrían generar mayores
cambios en la capacidad de formación de G4. Para caracterizar el efecto de las SNV-sG4
seleccionados en la formación y/o estabilidad de los G4 realizamos diversas técnicas
bioquímicas y espectroscópicas in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos. Esto nos
permitió restringir la selección a 12 SNV-sG4 de 4 genes, que fueron los que
evidenciaron cambios significativos en la formación y estabilidad del G4. Por último,
evaluamos las consecuencias de las SNV-sG4 que afecten la formación y/o estabilidad
de los G4 sobre la expresión génica transcripcional en el contexto celular. Para ello se
clonaron las sG4 en un sistema de gen reportero, corriente arriba del promotor básico (SV40) que regula el gen que codifica a la luciferasa de luciérnaga en el plasmídico pGL3-
Promoter Vector (pGL3-PV, Promega). Estas construcciones fueron transfectadas en la
línea celular humana Human Embrionic Kidney o HEK-293 y se evaluaron los niveles de
actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Pudimos observar variaciones
significativas en los niveles de actividad del reportero regulado por el promotor SV40 en
presencia de las SNV en comparación con las sG4. También, utilizando la regulación
transcripcional del proto-oncogen c-MYC mediada por G4 como modelo de estudio, se
analizó el efecto de las SNV-sG4 en el contexto del promotor mediante el clonado de un
fragmento 850 pb (pares de bases), (-337/+513 respecto del sitio de inicio de la
transcripción o TSS) del promotor del gen, el cual contiene a la sG4, y la generación de
las SNV-sG4 en estudio para esa sG4. Las construcciones fueron transfectadas en HEK293 evaluando los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección.
Como resultado de la transfecciones pudimos observar variaciones significativas de la
actividad del reportero para algunas de las SNV-sG4, respecto a la versión WT (wild
type). Estas evidencias nos permitieron inferir que la presencia de ciertas variantes
estaría influyendo en los niveles de expresión del gen reportero regulado por el
promotor de c-MYC en las construcciones plasmídicas.
Colectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis aportan nuevas evidencias
sobre el efecto de las SNV presentes en las sG4 sobre la formación de G4, tanto de
manera bioinformática como in vitro, y su influencia en la regulación de los niveles de
transcripción en un contexto celular. Los resultados recogidos en este trabajo sugieren
que las SNV-sG4 que alteran el plegamiento de G4 pueden ser la causa de la expresión
diferencial de genes y podrían considerarse como un nuevo mecanismo de etiología
molecular para la predisposición o el establecimiento de patologías humanas, como el
cáncer en el caso de los oncogenes.