Examinando por Autor "Calcaterra, Nora B."
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Ítem Acceso Abierto Beyond the binding site: In vivo Identification of tbx2, smarca5 and wnt5b as molecular targets of CNBP during embryonic development(Public Library of Science, 2013-05-07) Armas, Pablo; Margarit, Ezequiel; Mouguelar, Valeria; Allende, Miguel L.; Calcaterra, Nora B.CNBP is a nucleic acid chaperone implicated in vertebrate craniofacial development, as well as in myotonic dystrophy type 2 (DM2) and sporadic inclusion body myositis (sIBM) human muscle diseases. CNBP is highly conserved among vertebrates and has been implicated in transcriptional regulation; however, its DNA binding sites and molecular targets remain elusive. The main goal of this work was to identify CNBP DNA binding sites that might reveal target genes involved in vertebrate embryonic development. To accomplish this, we used a recently described yeast one-hybrid assay to identify DNA sequences bound in vivo by CNBP. Bioinformatic analyses revealed that these sequences are G-enriched and show high frequency of putative G-quadruplex DNA secondary structure. Moreover, an in silico approach enabled us to establish the CNBP DNA-binding site and to predict CNBP putative targets based on gene ontology terms and synexpression with CNBP. The direct interaction between CNBP and candidate genes was proved by EMSA and ChIP assays. Besides, the role of CNBP upon the identified genes was validated in loss-of-function experiments in developing zebrafish. We successfully confirmed that CNBP up-regulates tbx2b and smarca5, and down-regulates wnt5b gene expression. The highly stringent strategy used in this work allowed us to identify new CNBP target genes functionally important in different contexts of vertebrate embryonic development. Furthermore, it represents a novel approach toward understanding the biological function and regulatory networks involving CNBP in the biology of vertebrates.Ítem Acceso Abierto CNBP controls transcription by unfolding DNA G-quadruplex structures(Oxford University Press, 2019-06-20) David, Aldana P.; Pipier, Angélique; Pascutti, Federico; Binolfi, Andrés; Weiner, Andrea María Julia; Challier, Emilse; Heckel, Sofía; Calsou, Patrick; Gomez, Dennis; Calcaterra, Nora B.; Armas, PabloÍtem Acceso Abierto Conservation of zebrafish microrna-145 and its role during neural crest cell development(MDPI, 2021) Steeman, Tomás José; Rubiolo, Juan Andrés; Sánchez, Laura E.; Calcaterra, Nora B.; Weiner, Andrea María JuliaÍtem Acceso Abierto Cuádruplex de guanina y el desarrollo embrionario de los vertebrados(2019) David, Aldana P.; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.Los cuádruplex de guanina (G4s) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de G4s en organismos multicelulares y del rol de los mismos en la regulación transcripcional in vivo. Para abordar esta temática, se estudió la función de los G4s en la regulación transcripcional de genes involucrados en el desarrollo embrionario de vertebrados. Para esto se realizó una búsqueda in silico de secuencias con potencialidad de formar G4s (PQSs) conservadas dentro de las regiones promotoras proximales de genes de humano, ratón y pez cebra involucrados en el desarrollo embrionario. Las PQSs presentes en los promotores de los genes nog, col2a1 y fzd5 se seleccionaron entre aquellas capaces de plegarse in vitro como G4s para ensayar su funcionalidad como reguladores transcripcionales en ensayos in cellulo en células Neuro2a e in vivo en embriones de pez cebra. Los G4s seleccionados no solo fueron capaces de modular la transcripción, sino que la interrupción in vivo de los G4s en embriones de pez cebra en desarrollo resultó en fenotipos similares a los reportados para la reducción de la expresión de los genes analizados. En particular, la interrupción del G4 de nog3 ocasionó malformaciones craneofaciales consistentes con la función del gen en el desarrollo. A continuación, se estudió la función de la proteína celular de unión a ácidos nucleicos (CNBP) sobre la regulación transcripcional mediada por G4. CNBP es una chaperona de ácidos nucleicos capaz de interaccionar con secuencias ricas en guanina que es esencial para el correcto desarrollo craneofacial. Un análisis in silico predijo que los G4s que controlan la transcripción del gen humano y de pez cebra de nog (NOG- G4 y nog3-G4, respectivamente) se solapan con la secuencia de unión al ADN de CNBP. Ensayos in vitro mostraron que CNBP es capaz de desplegar las estructuras NOG-G4 y nog3-G4. Ensayos in cellulo en células HeLa e in vivo en embriones de pez cebra revelaron un rol represor de CNBP sobre la transcripción de nog, probablemente mediada por la desestructuración de los G4s. Finalmente, se determinó la actividad de CNBP sobre la transcripción de protooncogenes regulados por G4s en sus promotores, identificando a KRAS como un nuevo blanco de activación transcripcional de CNBP a través de la desestructuración de G4s. Este trabajo revela el rol transcripcional que cumplen G4s evolutivamente conservados durante el desarrollo embrionario, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de una proteína capaz de desarmar estructuras G4 introduciendo nuevos genes blancos para la misma y reafirmando la importancia de las proteínas moduladoras de G4s sobre la función biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.Ítem Acceso Abierto G-quadruplexes as novel cis-elements controlling transcription during embryonic development(Oxford University Press, 2016-01-14) David, Aldana P.; Margarit, Ezequiel; Domizi, Pablo; Banchio, Claudia; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.G-quadruplexes are dynamic structures folded in G-rich single-stranded DNA regions. These structures have been recognized as a potential nucleic acid based mechanism for regulating multiple cellular processes such as replication, transcription and genomic maintenance. So far, their transcriptional role in vivo during vertebrate embryonic development has not yet been addressed. Here, we performed an in silico search to find conserved putative G-quadruplex sequences (PQSs) within proximal promoter regions of human, mouse and zebrafish developmental genes. Among the PQSs able to fold in vitro as G-quadruplex, those present in nog3, col2a1 and fzd5 promoters were selected for further studies. In cellulo studies revealed that the selected G-quadruplexes affected the transcription of luciferase controlled by the SV40 nonrelated promoter. G-quadruplex disruption in vivo by microinjection in zebrafish embryos of either small ligands or DNA oligonucleotides complementary to the selected PQSs resulted in lower transcription of the targeted genes. Moreover, zebrafish embryos and larvae phenotypes caused by the presence of complementary oligonucleotides fully resembled those ones reported for nog3, col2a1 and fzd5 morphants. To our knowledge, this is the first work revealing in vivo the role of conserved G-quadruplexes in the embryonic development, one of the most regulated processes of the vertebrates biology.Ítem Acceso Abierto Genetic variations in G-quadruplex forming sequences affect the transcription of human disease-related genes(Oxford University Press, 2023-11-01) Lorenzatti, Agustín; Piga, Ernesto José; Gismondi, Mauro; Binolfi, Andrés; Margarit, Ezequiel; Calcaterra, Nora B.; Armas, PabloGuanine-rich DNA strands can fold into non-canonical four-stranded secondary structures named G-quadruplexes (G4s). G4s folded in proximal promoter regions (PPR) are associated either with positive or negative transcriptional regulation. Given that single nucleotide variants (SNVs) affecting G4 folding (G4-Vars) may alter gene transcription, and that SNVs are associated with the human diseases’ onset, we undertook a novel comprehensive study of the G4-Vars genome-wide (G4-variome) to find disease-associated G4-Vars located into PPRs. We developed a bioinformatics strategy to find disease-related SNVs located into PPRs simultaneously overlapping with putative G4-forming sequences (PQSs). We studied five G4-Vars disturbing in vitro the folding and stability of the G4s located into PPRs, which had been formerly associated with sporadic Alzheimer’s disease (GRIN2B), a severe familiar coagulopathy (F7), atopic dermatitis (CSF2), myocardial infarction (SIRT1) and deafness (LHFPL5). Results obtained in cultured cells for these five G4-Vars suggest that the changes in the G4s affect the transcription, potentially contributing to the development of the mentioned diseases. Collectively, data reinforce the general idea that G4-Vars may impact on the different susceptibilities to human genetic diseases’ onset, and could be novel targets for diagnosis and drug design in precision medicine.Ítem Acceso Abierto NERNST: a genetically-encoded ratiometric non-destructive sensing tool to estimate NADP(H) redox status in bacterial, plant and animal systems(Nature Research, 2023-06-06) Molinari, Pamela Estefanía; Krapp, Adriana R.; Weiner, Andrea María Julia; Beyer, Hannes M.; Kondadi, Arun Kumar; Blomeier, Tim; López, Melina; Bustos Sanmamed, Pilar; Tevere, Evelyn; Weber, Wilfried; Reichert, Andreas S.; Calcaterra, Nora B.; Beller, Mathias; Carrillo, Néstor; Zurbriggen, Matias D.Ítem Embargo Rol de los microARNs durante el desarrollo embrionario de los vertebrados(2023) Steeman, Tomás José; Calcaterra, Nora B.El desarrollo embrionario es un proceso altamente complejo y finamente regulado, gobernado por una detallada red de regulación génica (RRG) donde intervienen un gran número de elementos regulatorios como, por ejemplo, los miARNs. Estas moléculas de ARN de aproximadamente 22 nucleótidos de simple cadena, endógenos y no codificantes actúan a nivel de estabilidad de ARNm y de regulación traduccional. Si bien se han descripto numerosos miARNs involucrados en el desarrollo embrionario, aún queda por elucidar los mecanismos que controlan la expresión de estos miARNs. En este trabajo de Tesis se estudió el rol regulatorio de los Cuádruplex de Guanina (G4s), unas estructuras secundarias no-canónicas de los ácidos nucleicos formadas en secuencias ricas en guanina, sobre la biogénesis de miARNs. Para esto, se utilizó como caso de estudio el miR-150, el cual contiene una secuencia putativa de formación de G4 (pG4) en su precursor. Mediante distintas técnicas biofísicas se demostró la formación de un G4 de elevada estabilidad en una sonda de ARN con la secuencia del pG4. Por inhibición de la formación del G4 o mediante su estabilización, se observó in vivo en embriones de pez cebra el efecto inhibitorio del G4 sobre la biogénesis del miR-150, con el consecuente efecto sobre un gen blanco regulatorio del miARN, el protooncogén myb, y sobre el desarrollo embrionario. De esta forma se demostró que los G4s presentes en pre-miARNs puede funcionar como un interruptor estructural en la biogénesis de miARNs. La cresta neural (CN) es una estructura transitoria que se forma durante el desarrollo embrionario y da lugar a un gran número de derivados del organismo adulto. Las células de la CN (CCN) sufren una serie de eventos compartidos con las células que se desarrollan en tumores, como la delaminación, migración e invasión. Es por lo tanto de especial interés el estudio de los mecanismos que regulan estos procesos. Se han identificado miARNs que participan en la tumorigénesis o en el desarrollo de la CN, pero poco se sabe sobre la vinculación entre ambos. Con dos enfoques distintos (partiendo de miARNs que puedan regular genes de la RRG de la CN, o de miARNs que estén sobrerrepresentados en CN) se seleccionaron tres miARNs involucrados en la tumorigénesis para caracterizar su rol en el desarrollo embrionario de Danio rerio. Mediante experimentos de pérdida o ganancia de función en embriones de pez cebra, se observó que los miR-145, miR-133a y miR-338-3p son capaces de regular la diferenciación de melanóforos, iridóforos, condrocitos, la apoptosis y la proliferación celular, así como la expresión de distintos genes de la RRG de la CN. Este trabajo revela el rol regulatorio transcripcional que cumplen miARNs evolutivamente conservados durante el desarrollo de la CN, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de los G4 capaces de interferir con el procesamiento de pre-miARNs, introduciendo nuevos puntos regulatorios dentro de la RRG del desarrollo embrionario y reafirmando la importancia biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.