Cuádruplex de guanina y el desarrollo embrionario de los vertebrados

Los cuádruplex de guanina (G4s) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de G4s en organismos multicelulares y del rol de los mismos en la regulación transcripcional in vivo. Para abordar esta temática, se estudió la función de los G4s en la regulación transcripcional de genes involucrados en el desarrollo embrionario de vertebrados. Para esto se realizó una búsqueda in silico de secuencias con potencialidad de formar G4s (PQSs) conservadas dentro de las regiones promotoras proximales de genes de humano, ratón y pez cebra involucrados en el desarrollo embrionario. Las PQSs presentes en los promotores de los genes nog, col2a1 y fzd5 se seleccionaron entre aquellas capaces de plegarse in vitro como G4s para ensayar su funcionalidad como reguladores transcripcionales en ensayos in cellulo en células Neuro2a e in vivo en embriones de pez cebra. Los G4s seleccionados no solo fueron capaces de modular la transcripción, sino que la interrupción in vivo de los G4s en embriones de pez cebra en desarrollo resultó en fenotipos similares a los reportados para la reducción de la expresión de los genes analizados. En particular, la interrupción del G4 de nog3 ocasionó malformaciones craneofaciales consistentes con la función del gen en el desarrollo. A continuación, se estudió la función de la proteína celular de unión a ácidos nucleicos (CNBP) sobre la regulación transcripcional mediada por G4. CNBP es una chaperona de ácidos nucleicos capaz de interaccionar con secuencias ricas en guanina que es esencial para el correcto desarrollo craneofacial. Un análisis in silico predijo que los G4s que controlan la transcripción del gen humano y de pez cebra de nog (NOG- G4 y nog3-G4, respectivamente) se solapan con la secuencia de unión al ADN de CNBP. Ensayos in vitro mostraron que CNBP es capaz de desplegar las estructuras NOG-G4 y nog3-G4. Ensayos in cellulo en células HeLa e in vivo en embriones de pez cebra revelaron un rol represor de CNBP sobre la transcripción de nog, probablemente mediada por la desestructuración de los G4s. Finalmente, se determinó la actividad de CNBP sobre la transcripción de protooncogenes regulados por G4s en sus promotores, identificando a KRAS como un nuevo blanco de activación transcripcional de CNBP a través de la desestructuración de G4s. Este trabajo revela el rol transcripcional que cumplen G4s evolutivamente conservados durante el desarrollo embrionario, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de una proteína capaz de desarmar estructuras G4 introduciendo nuevos genes blancos para la misma y reafirmando la importancia de las proteínas moduladoras de G4s sobre la función biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.