Examinando por Autor "David, Aldana P."
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Ítem Acceso Abierto CNBP controls transcription by unfolding DNA G-quadruplex structures(Oxford University Press, 2019-06-20) David, Aldana P.; Pipier, Angélique; Pascutti, Federico; Binolfi, Andrés; Weiner, Andrea María Julia; Challier, Emilse; Heckel, Sofía; Calsou, Patrick; Gomez, Dennis; Calcaterra, Nora B.; Armas, PabloÍtem Acceso Abierto Cuádruplex de guanina y el desarrollo embrionario de los vertebrados(2019) David, Aldana P.; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.Los cuádruplex de guanina (G4s) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de G4s en organismos multicelulares y del rol de los mismos en la regulación transcripcional in vivo. Para abordar esta temática, se estudió la función de los G4s en la regulación transcripcional de genes involucrados en el desarrollo embrionario de vertebrados. Para esto se realizó una búsqueda in silico de secuencias con potencialidad de formar G4s (PQSs) conservadas dentro de las regiones promotoras proximales de genes de humano, ratón y pez cebra involucrados en el desarrollo embrionario. Las PQSs presentes en los promotores de los genes nog, col2a1 y fzd5 se seleccionaron entre aquellas capaces de plegarse in vitro como G4s para ensayar su funcionalidad como reguladores transcripcionales en ensayos in cellulo en células Neuro2a e in vivo en embriones de pez cebra. Los G4s seleccionados no solo fueron capaces de modular la transcripción, sino que la interrupción in vivo de los G4s en embriones de pez cebra en desarrollo resultó en fenotipos similares a los reportados para la reducción de la expresión de los genes analizados. En particular, la interrupción del G4 de nog3 ocasionó malformaciones craneofaciales consistentes con la función del gen en el desarrollo. A continuación, se estudió la función de la proteína celular de unión a ácidos nucleicos (CNBP) sobre la regulación transcripcional mediada por G4. CNBP es una chaperona de ácidos nucleicos capaz de interaccionar con secuencias ricas en guanina que es esencial para el correcto desarrollo craneofacial. Un análisis in silico predijo que los G4s que controlan la transcripción del gen humano y de pez cebra de nog (NOG- G4 y nog3-G4, respectivamente) se solapan con la secuencia de unión al ADN de CNBP. Ensayos in vitro mostraron que CNBP es capaz de desplegar las estructuras NOG-G4 y nog3-G4. Ensayos in cellulo en células HeLa e in vivo en embriones de pez cebra revelaron un rol represor de CNBP sobre la transcripción de nog, probablemente mediada por la desestructuración de los G4s. Finalmente, se determinó la actividad de CNBP sobre la transcripción de protooncogenes regulados por G4s en sus promotores, identificando a KRAS como un nuevo blanco de activación transcripcional de CNBP a través de la desestructuración de G4s. Este trabajo revela el rol transcripcional que cumplen G4s evolutivamente conservados durante el desarrollo embrionario, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de una proteína capaz de desarmar estructuras G4 introduciendo nuevos genes blancos para la misma y reafirmando la importancia de las proteínas moduladoras de G4s sobre la función biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.Ítem Acceso Abierto G-quadruplexes as novel cis-elements controlling transcription during embryonic development(Oxford University Press, 2016-01-14) David, Aldana P.; Margarit, Ezequiel; Domizi, Pablo; Banchio, Claudia; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.G-quadruplexes are dynamic structures folded in G-rich single-stranded DNA regions. These structures have been recognized as a potential nucleic acid based mechanism for regulating multiple cellular processes such as replication, transcription and genomic maintenance. So far, their transcriptional role in vivo during vertebrate embryonic development has not yet been addressed. Here, we performed an in silico search to find conserved putative G-quadruplex sequences (PQSs) within proximal promoter regions of human, mouse and zebrafish developmental genes. Among the PQSs able to fold in vitro as G-quadruplex, those present in nog3, col2a1 and fzd5 promoters were selected for further studies. In cellulo studies revealed that the selected G-quadruplexes affected the transcription of luciferase controlled by the SV40 nonrelated promoter. G-quadruplex disruption in vivo by microinjection in zebrafish embryos of either small ligands or DNA oligonucleotides complementary to the selected PQSs resulted in lower transcription of the targeted genes. Moreover, zebrafish embryos and larvae phenotypes caused by the presence of complementary oligonucleotides fully resembled those ones reported for nog3, col2a1 and fzd5 morphants. To our knowledge, this is the first work revealing in vivo the role of conserved G-quadruplexes in the embryonic development, one of the most regulated processes of the vertebrates biology.