Biogénesis de grupos Fe-S en plantas : estudios bioquímicos, estructurales y regulatorios de frataxinas de Arabidopsis thaliana y Zea mays

Los grupos Fe-S son pequeñas moléculas inorgánicas con capacidad redox que se encuentran entre los cofactores más antiguos de la naturaleza. Las proteínas con centros Fe-S están involucradas en las principales rutas metabólicas y se encuentran ampliamente distribuidas en los tres reinos de la vida. La biosíntesis de estas moléculas requiere de un proceso controlado debido a que los iones Fe+2 y S-2 en sus formas libres son tóxicos para la célula. En organismos eucariotas y procariotas existen varios complejos proteicos encargados de la biosíntesis de los grupos Fe-S en diferentes situaciones fisiológicas denominados sistemas NIF, SUF, ISC y CIA. El mecanismo básico para el ensamblado de los grupos Fe-S en todos estos sistemas se puede dividir en dos etapas: la unión del hierro y el azufre a una proteína molde y la transferencia del centro Fe-S a las apoproteínas blanco mediado por chaperonas con especificidad variable. A partir de estudios en células de mamíferos y levaduras, se postuló la participación de frataxina en el ensamblado de centros Fe-S, así como también en el metabolismo energético mitocondrial, respiración y homeostasis del hierro. Frataxina es una proteína mitocondrial y está altamente conservada desde bacterias hasta mamíferos y plantas, sin presentar mayores cambios estructurales. Esto sugiere que esta proteína cumpliría funciones similares en todos estos organismos. Las plantas poseen tres sistemas que conducen a la formación de grupos Fe-S: el sistema ISC en mitocondrias, la maquinaria SUF en cloroplastos y el sistema CIA en el citosol. Debido a esta compartimentación, y a que las proteínas involucradas se encuentran principalmente codificadas en el núcleo, la regulación y la comunicación en y entre los tres sistemas parecen ser complejas y en su gran mayoría desconocidas. AtFH (frataxina de Arabidopsis thaliana) es una proteína esencial para el desarrollo. Líneas de Arabidopsis con niveles reducidos de esta proteína presentan retardo en el desarrollo, alto contenido de hierro mitocondrial, aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, menor contenido de hemo total y disminución en la actividad de hemoproteínas y de proteínas mitocondriales con centros Fe-S. AtFH tendría un rol importante en las mitocondrias de las plantas, participando en el almacenamiento de Fe biodisponible, en la atenuación del estrés oxidativo y en la formación de los grupos hemo y centros Fe-S. Además, actualmente se demostró que también está presente en cloroplastos. Recientemente, realizando una búsqueda en bases de datos de plantas de interés económico, encontramos que tanto maíz como soja y sorgo presentaban más de una isoforma de frataxina. En maíz identificamos dos genes que codificarían para diferentes frataxina en maíz. Con el fin de caracterizar las frataxinas de maíz, se expresaron y purificaron las versiones maduras de ZmFH42 y ZmFH55. Se realizó la caracterización bioquímica in vitro de las proteínas maduras y se comprobó su actividad in vivo mediante ensayos de complementación en levaduras knock out. También se estudió las propiedades de oligomerización de las mismas. El análisis de la secuencia primaria de ZmFH42 y ZmFH55 mostró que la región amino terminal presentan un posible péptido tránsito para el direccionamiento a mitocondria. Con el objetivo de determinar la localización subcelular de las mismas se generaron líneas de Arabidopsis que expresan una fusión del péptido tránsito predicho de ZmFH42 y ZmFH55 con la proteína fluorescente verde (EGFP). Los resultados obtenidos por microscopia confocal láser de fluorescencia demostraron que el péptido tránsito de las isoformas de maíz es capaz de direccionar EGFP tanto a mitocondrias como a cloroplastos. Además se determinaron los niveles de expresión de ambas isoformas en distintos tejidos de maíz. En trabajos previos en nuestro laboratorio se determinó el patrón de expresión de AtFH en diferentes estadios del desarrollo de Arabidopsis a partir de la construcción de fusiones transcripcionales de la secuencia promotora de AtFH a la secuencia codificante de la enzima β-glucuronidasa (GUS). La expresión de GUS se observó principalmente en tejidos meristemáticos, en granos polen y durante los primeros estadios del desarrollo de la semilla. Considerando que la presencia de algunos intrones pueden modificar los niveles de expresión de ciertos genes en plantas, entonces se estudió también el efecto del primer intrón de AtFH. Se determinó que la presencia de la secuencia correspondiente al primer intrón AtFH modifica notablemente la expresión de este gen. Los resultados anteriores indican AtFH se expresa en tejidos y órganos con un alto requerimiento energético, sugiriendo un rol importante para ambas proteínas en el metabolismo mitocondrial de Arabidopsis. Además se demostró que la secuencia promotora de AtFH contiene los elementos reguladores ABRE y RY que modulan la expresión génica, y que esta regulación está compartida con otro gen de la síntesis de centro Fe-S, la cisteína desulfurasa AtNfs1. En conjunto, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis contribuyen a comprender mejor las funciones de los homólogos a frataxina en plantas superiores.