(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Participación de AKAP350 en la sinapsis inmune en células Natural Killer
(2022) Pariani, Alejandro Pedro; Larocca, María Cecilia
Las células Natural Killer (NK) son células efectoras del sistema inmune innato que poseen la capacidad de eliminar células infectadas con virus y células tumorales. La citotoxicidad de las células NK requiere una remodelación extensa del citoesqueleto y una reorganización de los receptores de membrana en la sinapsis inmune (SI) establecida entre las células NK y las células blanco. Uno de estos receptores es la integrina αLβ2 (CD11a/CD18) o Leucocyte function associated antigen (LFA)-1, la cual es esencial para la formación y maduración de la SI. Al unirse a su ligando ICAM-1, LFA-1 no sólo actúa como una molécula de adhesión que permite una unión más fuerte con la célula blanco, sino que también transmite señales tempranas que promueven la activación de la célula NK. Los mecanismos por los cuales LFA-1 se acumula y organiza en el sitio de sinapsis en estas células no han sido totalmente clarificados hasta el momento. AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejos proteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi (AG). AKAP350 está implicada en procesos de generación de asimetría celular, a través de su capacidad de facilitar la transmisión de señales, como así también a través de su rol en la regulación de la dinámica de los microtúbulos. Respecto a su función en los linfocitos, la proteína AKAP350 es necesaria para la activación de LFA-1 en células T, asociada tanto a procesos de migración, como a la activación por reconocimiento de un antígeno. Los mecanismos involucrados aún no fueron determinados. En esta Tesis se analizó la participación de AKAP350 en los mecanismos involucrados en la actividad citotóxica y formación de la SI citolítica en células Natural Killer. Para esto utilizamos un sistema lentiviral de expresión de shRNA específicos para disminuir la expresión de AKAP350 (AKAP350KD) en una línea celular derivada de NK humanas, YTS, y en células NK aisladas de sangre periférica humana. Nuestros resultados mostraron que la disminución de la expresión de AKAP350 inhibió la capacidad efectora lítica de las células YTS. Esto se correlacionó con una alteración en la polarización del centrosoma y los gránulos líticos al sitio de sinapsis, y con un descenso en la acumulación de LFA-1 en la SI en células AKAP350KD, tanto al ser activadas por una célula blanco, como al ser activadas selectivamente a través de LFA-1. En experimentos realizados en células YTS y en cultivos ex vivo de células NK, se observó la presencia de un pool intracelular de vesículas que contienen LFA-1, asociadas parcialmente al AG, que polarizó hacía la SI mediante un mecanismo dependiente de AKAP350. Nuestros resultados demostraron que, así como sucede en células no inmunes, AKAP350 participa en la nucleación de microtúbulos en el AG. La disrupción del AG o la alteración de la dinámica de microtúbulos afectó la organización de LFA-1 en la SI. Este efecto también se observó cuando AKAP350 fue desplazada del AG en células YTS. Por lo tanto, el presente trabajo caracteriza la participación de AKAP350 en la actividad citotóxica de las células NK y revela un nuevo mecanismo mediante el cual el AG y, específicamente, la AKAP350 asociada al mismo, facilita el tráfico intracelular de LFA-1, el cual es de suma relevancia para la organización de LFA-1 en el sitio de sinapsis.
Determinación del mecanismo de acción de los endocannabinoides en Caenorhabditis elegans
(2023) Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Binolfi, Andrés
El colesterol es un lípido esencial constituyente de las membranas de las células eucariotas. Su función principal es estructural pero también lleva a cabo funciones como molécula de señalización. Por ello, la regulación del metabolismo colesterol es crucial para el normal funcionamiento de las células. En el nematodo Caernohabditis elegans (C. elegans), existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. En los últimos años, se ha propuesto que un conjunto de lípidos denominados N-aciletanolaminas (NAEs), antagonizan la detención del desarrollo de los nematodos [1]. Más recientemente, nuestro grupo de laboratorio demostró que otra clase de lípidos, los endocannabinoides (eCBs), regulan el ciclo de vida de C. elegans mediante la promoción de la movilización de colesterol [2]. Sin embargo, el mecanismo y las vías de señalización activadas por los eCBs para movilizar colesterol no son conocidas. Adicionalmente, numerosos trabajos sugieren un rol directo de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas [3] y cardiovasculares [4], sugiriendo que algunos ácidos grasos (AGs) regulan el desarrollo de diversas enfermedades. A pesar de que se ha avanzado mucho en el entendimiento del rol que juegan los lípidos para el mantenimiento de la homeostasis celular, su funcionalidad como moléculas de señalización esta superficialmente estudiada. Por este motivo, en este trabajo de tesis tratamos de elucidar como los eCBs actúan como moléculas de señalización promoviendo el transporte del colesterol en C. elegans. Pudimos identificar diferentes proteínas involucradas en la vía de señalización activada por 2-O-araquidonoil glicerol (2-AG), eCB derivado de ácido araquidónico (20:4 ω-6) [5], que estimula el transporte de colesterol. Nuestros experimentos sugieren que el 2-AG estimula la movilización de colesterol por un mecanismo dependiente de los receptores del tipo TRPV (de sus siglas en inglés: Transient Receptor Potential Vainoillid), la liberación de vesículas de núcleo denso como también de la vía de señalización de la insulina Por otra parte, desarrollamos metodologías de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) como metodología para el estudio del metabolismo de AGs in vivo en C. elegans. Este procedimiento nos permitió estudiar cómo se modifican los AGs y otros metabolitos en diferentes cepas mutantes y así identificar nuevos componentes involucrados en la vía de señalización desencadenada por el ortólogo a los receptores de adiponectina (AdipoR1 y AdipoR2), PAQR-2, en condiciones de baja temperatura [6–8]. Estos descubrimientos demuestran, por un lado, de forma precisa que vías de señalización son activadas por 2-AG en la regulación del tráfico de colesterol y, por el otro, aportan, claridad para el estudio del rol de los AGs como moléculas de señalización.
Variantes genéticas en secuencias formadoras de cuádruplex de guanina: consecuencias sobre la expresión de genes asociados a patologías humanas
(2023) Piga, Ernesto José; Armas, Pablo
Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. En particular, existe gran cantidad de evidencia sobre la regulación de genes asociados al desarrollo de patologías humanas mediada por G4, principalmente de proto-oncogenes. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de las variantes genéticas presentes en las secuencias con capacidad de formar G4 (sG4), y el efecto que las mismas generaban sobre los G4. Por este motivo decidimos investigar si las SNV (de las siglas del término en inglés single nucleotide variants) presentes en los G4 podrían contribuir a la expresión génica diferencial entre individuos que pueda conducir a la predisposición o al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esto se realizó una búsqueda y selección bioinformática de SNV en secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) localizadas en regiones reguladoras de la transcripción de genes asociados con patologías humanas. Realizamos una búsqueda bibliográfica orientada en dos ejes. El primero fue buscar SNV-sG4 asociadas a variaciones transcripcionales reportadas en la literatura, y el segundo eje se enfocó en la búsqueda de sG4 en regiones promotoras proximales y con funciones en la regulación de la transcripción de proto-oncogenes reportados en la bibliografía y la posterior identificación de SNV presentes en esas sG4. Los resultados de la búsqueda rindieron 14 genes con 88 SNV-sG4 presentes en ellos. Luego se analizaron las secuencias de las sG4 utilizando predictores bioinformáticos de G4 para comparar y seleccionar 43 SNV-sG4 de 14 genes que podrían generar mayores cambios en la capacidad de formación de G4. Para caracterizar el efecto de las SNV-sG4 seleccionados en la formación y/o estabilidad de los G4 realizamos diversas técnicas bioquímicas y espectroscópicas in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos. Esto nos permitió restringir la selección a 12 SNV-sG4 de 4 genes, que fueron los que evidenciaron cambios significativos en la formación y estabilidad del G4. Por último, evaluamos las consecuencias de las SNV-sG4 que afecten la formación y/o estabilidad de los G4 sobre la expresión génica transcripcional en el contexto celular. Para ello se clonaron las sG4 en un sistema de gen reportero, corriente arriba del promotor básico (SV40) que regula el gen que codifica a la luciferasa de luciérnaga en el plasmídico pGL3- Promoter Vector (pGL3-PV, Promega). Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular humana Human Embrionic Kidney o HEK-293 y se evaluaron los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Pudimos observar variaciones significativas en los niveles de actividad del reportero regulado por el promotor SV40 en presencia de las SNV en comparación con las sG4. También, utilizando la regulación transcripcional del proto-oncogen c-MYC mediada por G4 como modelo de estudio, se analizó el efecto de las SNV-sG4 en el contexto del promotor mediante el clonado de un fragmento 850 pb (pares de bases), (-337/+513 respecto del sitio de inicio de la transcripción o TSS) del promotor del gen, el cual contiene a la sG4, y la generación de las SNV-sG4 en estudio para esa sG4. Las construcciones fueron transfectadas en HEK293 evaluando los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Como resultado de la transfecciones pudimos observar variaciones significativas de la actividad del reportero para algunas de las SNV-sG4, respecto a la versión WT (wild type). Estas evidencias nos permitieron inferir que la presencia de ciertas variantes estaría influyendo en los niveles de expresión del gen reportero regulado por el promotor de c-MYC en las construcciones plasmídicas. Colectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis aportan nuevas evidencias sobre el efecto de las SNV presentes en las sG4 sobre la formación de G4, tanto de manera bioinformática como in vitro, y su influencia en la regulación de los niveles de transcripción en un contexto celular. Los resultados recogidos en este trabajo sugieren que las SNV-sG4 que alteran el plegamiento de G4 pueden ser la causa de la expresión diferencial de genes y podrían considerarse como un nuevo mecanismo de etiología molecular para la predisposición o el establecimiento de patologías humanas, como el cáncer en el caso de los oncogenes.
Modelización físico-biológica del efecto hemorreológico in vitro de anestésicos. Implicancias en la diabetes mellitus
(2023) Batista da Silva, Marcus V.; Alet, Analía I.; Riquelme, Bibiana Doris
La diabetes es un grupo de trastornos metabólicos que se caracteriza por hiperglucemia y por el aumento de otros parámetros sanguíneos dependiendo del tipo de diabetes. Debido a esta condición, los glóbulos rojos (GR) son modificados químicamente por efecto de la glicación, la cual produce una disminución de la carga eléctrica superficial negativa, reduciendo la repulsión electrostática, lo cual favorece la agregación eritrocitaria y altera los parámetros hemorreológicos. Por otra parte, se ha observado que las diferentes drogas empleadas en anestesia pueden afectar los parámetros hemorreológicos y hemostáticos. Los anestésicos aplicados por vía intravenosa más usuales consisten en una combinación de propofol (P), remifentanilo (R) y bromuro de vecuronio (V). El propofol es un agente hipnótico de corta duración y rápida recuperación anestésica. El remifentanilo es un analgésico, y se emplea para la inducción y mantenimiento de la anestesia general. El bromuro de vecuronio es un bloqueador neuromuscular no despolarizante que se usa para la relajación muscular. Dado que los pacientes diabéticos presentan alteraciones hemorreológicas de base, el uso de anestésicos podría agravarlas. Por este motivo la detección y cuantificación de dichas alteraciones antes de una cirugía sería de gran importancia para tomar medidas preventivas y obtener el máximo beneficio para el paciente. En esta Tesis, mediante un estudio hemorreológico in vitro, se propuso modelizar cómo los compuestos anestésicos pueden modificar la capacidad de agregación y la viscoelasticidad de los GR humanos glicados in vitro, a concentraciones cercanas a las alcanzadas en plasma y sangre durante una cirugía (steady-state). Para ello, a fin de modelizar in vitro el proceso de glicación debido a la hiperglucemia, se incubaron GR de dadores sanos con una solución de glucosa a una concentración final de 0,5% p/v (correspondiente a una glucemia de 0,5 g/dl). Para modelizar in vitro el efecto de los anestésicos sobre los GR glicados (g) y sin glicar (C) (suspendidos al 40% en plasma autólogo), estos fueron incubados con soluciones de los distintos anestésicos en PBS, siendo la concentración final de incubación la presentada en steady-state durante una cirugía. La incubación se realizó tanto con cada anestésico por separado (P, R y V) como con sus combinaciones (PR, PV, RV y PRV). Al analizar la morfología de los agregados de los GR por microscopía óptica, se observó que en el tratamiento con los anestésicos P, V, PV y PRV presentó un incremento significativo en el porcentaje de los agregados de 5 o más células con respecto al control (C), indicando que estos anestésicos influirían en el comportamiento de la agregación eritrocitaria. También se encontró un aumento significativo para el porcentaje de AMAS en el tratamiento con PRV, indicando que la combinación de los tres anestésicos aumentaría la agregación. En concordancia con esto, hubo un aumento significativo para el porcentaje de AMAS entre g y PRVg revelando que el tratamiento conjunto de anestesia y glicación también aumentaría significativamente la agregación. Al analizar la cinética de agregación de los GR con un agregámetro de chip óptico (basado en la técnica de transmisión láser), se pudo observar que el tiempo mitad (t1/2) presentó una disminución significativa para PRV, indicando que la mezcla de los tres anestésicos aceleraría el proceso de agregación. Además, se observó un aumento significativo de la amplitud de agregación (Amp/2) para la muestra g al comparar con el C. Se analizaron los parámetros hemorreológicos empleando el Reómetro Eritrocitario, basado en la técnica de difractometría láser. Se pudo observar que el módulo elástico de la membrana del GR () disminuyó significativamente para el tratamiento con PRV respecto a C, revelando una posible alteración de la elasticidad de la membrana eritrocitaria por la acción de esta combinación de anestésicos. Al analizar los efectos debido a la glicación, se observó que los valores de la viscosidad superficial de membrana () y el  presentaron diferencia significativa para los GR glicados, sugiriendo alteraciones en la viscoelasticidad por este tratamiento. Asimismo, se observó que el valor de μ disminuyó significativamente en las muestras Rg, PRg, RVg y PRVg respecto al g. Finalmente, los resultados de las determinaciones viscoelásticas y de agregación eritrocitaria indican que las propiedades hemorreológicas de los GR podrían estar afectadas en diferente grado por la acción de los anestésicos propofol, remifentanilo y vecuronio, solos o en combinación. Además, los resultados obtenidos aplicando la modelización in vitro de la glicación por hiperglucemia, muestran que las alteraciones hemorreológicas podrían ser mayores por el uso de estos anestésicos. Particularmente, se observó que los GR formarían agregados anómalos (clusters) y de mayor tamaño por efecto de los anestésicos y la concentración de glucosa. Los resultados de esta tesis son de gran importancia para la evaluación de la prevención de complicaciones en procedimientos quirúrgicos, y también para evitar posibles complicaciones microvasculares postoperatorias en pacientes diabéticos.
Desarrollo de trampas cebadas para la captura de Triatoma infestans, vector de la Enfermedad de Chagas, estudios neurofisiológicos y comportamentales
(2023) Ibarra Bouzada, Lucía María Esther; Guerenstein, Pablo Gustavo; Cecere, María Carla
En Sudamérica, Triatoma infestans es el principal vector del protozoo Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Actualmente existen diversos problemas en cuanto al control vectorial de triatominos: reinsfestación desde peridomicilio a domicilio luego del rociado con insecticidas, triatominos con hábitos silvestres migrando al peridomicilio, creciente infestación en zonas urbanas, aparición de resistencia a piretroides. Para optimizar la toma de decisiones para el control resulta necesario el desarrollo de herramientas de monitoreo y detección temprana de la presencia de vinchucas. Por tal motivo, nos propusimos desarrollar trampas cebadas que induzcan un alto nivel de captura de T. infestans, a través de estudios neurofisiológicos y comportamentales. En cuanto al estudio neurofisiológico, a través de registros extracelulares multicanal en cerebro se profundizó el conocimiento sobre el sistema olfativo de T. infestans. Se evaluaron olores de hospedador, tanto sintéticos (ej. α-pineno) como naturales (ej. pluma de gallina) con el fin de determinar las respuestas de neuronas olfativas del lóbulo antenal. Dichas neuronas respondieron a olores de vertebrados mostrando respuestas de excitación e inhibición. En cuanto a estudios comportamentales, para evaluar trampas se empleó un diseño sumamente práctico de cajas experimentales que simulan un ambiente natural bajo condiciones de laboratorio. Se desarrollaron 2 tipos de trampas cebadas con una mezcla de olores de hospedador, que demostraron ser eficientes en la captura de triatominos. También se evaluó la emisión de los componentes del cebo de olor, concluyéndose que estos aún están presentes a los 4 días de preparado el cebo. Posteriormente se diseñó y evaluó una trampa con un cebo sintético multimodal que consistió en la fuente de olores, una fuente de calor (cera de parafina) y una de CO2 (levadura seca + sacarosa + agua). Esta demostró capturar tantos individuos como una trampa con hospedador vivo como cebo, aumentando la captura de la trampa con cebo de olor solo. A partir de ello, se decidió evaluar el papel que desempeñan los componentes del cebo multimodal en la captura, encontrando que una trampa cebada con olores + CO2 captura tanto como una trampa cebada con olores + calor + CO2, y que una trampa cebada con olor + calor anula la captura de triatominos. También se observó que una trampa cebada con olores + CO2 tiende a capturar más que una trampa cebada solo con CO2, o solo con olor, aunque no se encontraron diferencias significativas entre las capturas de las trampas cebadas con estos tres tratamientos. Se midió la temperatura de la fuente de calor desde que la cera de parafina fue derretida hasta los 90 minutos, obteniéndose una temperatura de 46.2°C a los 15 minutos (momento en que se comenzaba el ensayo), descendiendo hasta los 90 minutos (25.9°C – temperatura ambiental). También se cuantificó la temperatura sobre la trampa, la cual se mantuvo por encima de la temperatura ambiental durante 100 minutos desde que se colocó en la trampa. Se cuantificó la concentración de CO2 emitido por la trampa durante las primeras horas del ensayo (270 min). Este gas alcanzó su máxima concentración (717ppm) a los 60 minutos; luego disminuyó progresivamente hasta los 110 minutos alcanzando la concentración del ambiente (ca. 570 ppm). Ante la necesidad de contar con nuevas herramientas que permitan monitorear la presencia de triatominos, principalmente T. infestans, el desarrollo de trampas cebadas con olores y CO2 (cultivo de levadura) resulta útil. Si bien la trampa cebada resultó ser eficiente en la captura de triatominos en los ensayos en cajas experimentales, aún es necesario que sea ensayada en condiciones de campo para evaluar su desempeño bajo condiciones naturales.
Estudio del mecanismo de activación del sistema VraSRT de Staphylococcus aureus y búsqueda de inhibidores producidos por actinomicetos
(2023) Antinori, Melisa Belén; Llarrull, Leticia I.
Staphylococcus aureus es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. El sistema VraSRT detecta daños en el peptidoglicano de la pared celular y coordina una respuesta que conduce a la resistencia a los antibióticos. Presenta un mecanismo de activación aún no esclarecido y está formado por 3 proteínas: una histidin quinasa de membrana (VraS), un regulador de respuesta citoplasmático (VraR) y otra proteína de membrana esencial, cuya función se desconoce (VraT). En este trabajo de tesis se realizaron experimentos in vitro e in vivo para investigar la activación del sistema VraSRT y los acontecimientos moleculares implicados en la transducción de señal que conducen a la resistencia. Se construyó y validó una cepa reportera que permite la expresión de GFP bajo el control del sistema VraSRT. Se confirmó que el sistema VraSRT sólo responde a la presencia de antibióticos que dañan la pared celular y se descubrió que el sistema VraSRT no se activa en respuesta a fragmentos del peptidoglicano generados por la acción de las enzimas lisostafina y mutanolisina, involucradas en el remodelado de la pared celular. También se evaluó la interacción entre VraS, VraT y diferentes fotosondas de afinidad derivadas del antibiótico β-lactámico ampicilina (FS-Amp) y del antibiótico glicopéptido vancomicina (VPP). Se verificó que las modificaciones químicas introducidas en los antibióticos para generar las fotosondas de afinidad no afectaron su capacidad de inducir al sistema VraSRT. Se logró sobre-expresar y localizar correctamente en membrana las proteínas VraS y VraT en células E. coli BL21 StarTM (DE3). Se observó un retraso en la movilidad electroforética tras la incubación e irradiación de VraS con las fotosondas de ampicilina, lo que sugiere la presencia de un aducto VraS-FS-Amp. Fue posible purificar dicho aducto pero no se pudo corroborar la formación del mismo. Se confirmó la existencia de un aducto VraS-VPP, lo que demostró una interacción directa entre VraS y la vancomicina. Si bien no fue posible confirmar el lugar exacto de la interacción, ensayos preliminares sugieren que la interacción se daría a través del péptido T 41QIF. La proteína VraS purificada no conservó la actividad auto-quinasa. Sin embargo, la proteína en membranas de E. coli y reconstituida en liposomas luego de ser purificada mostró actividad auto-quinasa constitutiva. Con respecto a VraT, los ensayos con las fotosondas derivadas de antibióticos permitieron descartar una interacción directa con esta proteína. Además, se examinó una mezcla de compuestos secretados por 40 cepas diferentes de actinomicetos utilizando la cepa reportera y se identificaron varias que impedían la activación del sistema de resistencia. También se observó que algunos de estos extractos restablecían la eficacia de los antibióticos frente a cepas clínicas resistentes. En conclusión, el sistema VraSRT es una importante vía de señalización que desempeña un papel clave en la resistencia de S. aureus a los antibióticos. Esta tesis permitió dilucidar nuevos aspectos del mecanismo de activación del sistema VraSRT; específicamente, se demostró la existencia de una interacción directa de la proteína VraS con el antibiótico glicopéptido vancomicina sin que esta interacción modifique notoriamente la actividad auto-quinasa basal de VraS. Además, se identificaron extractos de actinomicetos con compuestos con potencial terapéutico, abriéndose así una nueva línea de investigación para la determinación de la estructura de estos compuestos y del mecanismo de acción.
Caracterización molecular de haplotipos Rh variantes. Implicancia en medicina transfusional
(2023) Principi, Cintia Soledad; Cotorruelo, Carlos; Trucco Boggione, Carolina
El sistema Rh posee gran importancia clínica debido a la inmunogenicidad de sus antígenos, y a la participación de sus anticuerpos en la patogénesis de la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de reacciones hemolíticas transfusionales y de algunas anemias hemolíticas autoinmunes (8, 73). El locus RH está compuesto por dos genes homólogos denominados RHD y RHCE, que codifican las proteínas transmembranales eritrocitarias RhD y RhCE, respectivamente (180). Este sistema presenta gran variabilidad alélica, que se traduce en fenotipos con expresión parcial o débil de los antígenos y en deleciones parciales o totales de las proteínas (15). El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas muestran con los antisueros monoclonales restringe la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. El conocimiento de las bases genéticas del sistema Rh permitirá implementar estrategias moleculares útiles para identificar inequívocamente el alelo responsable del fenotipo Rh. En este trabajo de Tesis hemos investigado los eventos genéticos responsables de la variabilidad en la expresión de los antígenos Rh y analizado la asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE. Además, hemos validado una estrategia molecular para la detección de sustituciones, insersiones y deleciones nucleotidicas, presencia/ausencia y variación del número de copias de exones de los genes RH para la identificación de fenotipos con genotipo desconocido. En este trabajo de Tesis se analizaron las bases moleculares responsables de alteraciones en la expresión de los antígenos D y E encontradas en un donante de sangre y su familia. Mediante diferentes estrategias de biología molecular se han elucidado las bases genéticas que subyacen en la expresión aberrante de estos antígenos. Los resultados obtenidos mostraron que el donante y sus dos hijos son portadores del haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHCE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. Para confirmar este hallazgo, se estudiaron posteriormente 17 muestras de ADN de donantes portadores del alelo RHD*DEL43 y su asociación con la variante alélica RHCE*ce.37. Este estudio permitió identificar el haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37 en el 64,71% de las muestras estudiadas, demostrando una fuerte asociación entre ambas variantes RH. Posteriormente, se estudió la asociación entre los alelos RHD*D débil tipo 1 en R0 y RHD*D débil tipo 4, hallados con alta prevalencia en individuos con fenotipo D variante de nuestra población (104, 164), con los polimorfismos más frecuentemente encontrados en variantes alélicas RHCE (c.48C en el exón 1 y c.733G en el exón 5). Se estudiaron 32 muestras de ADN provenientes de individuos con genotipo RHD*D débil tipo 1 en R0 (n=15) y de individuos con fenotipo Dccee (n=17 como grupo control) y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados obtenidos mostraron que en el 100% de las muestras portadoras del alelo RHD*D débil tipo 1 en R0 y en el 76,47% de las muestras con fenotipo Dccee se identificaron los polimorfismos c.48C y c.48G. Estos estudios moleculares sugieren un desequilibrio de ligamiento entre los alelos RHD*D débil tipo 1 y el alelo RHD normal cuando se encuentran en haplotipo R0 con la variante alélica RHCE*ce (48C). En cuanto al estudio llevado a cabo para la detección del polimorfismo c.733G, los resultados moleculares sugieren que no existe asociación entre las variantes RHD analizadas y el alelo RHCE*ce (733G). En una etapa posterior, se estudiaron 61 muestras RHD*D débil tipo 4 y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados de este análisis permitieron determinar que hay una asociación del 86,89% entre el alelo RHD*D débil tipo 4 y los polimorfismos c.48C, c.733G. Con el objetivo de establecer si los polimorfismos c.48C y c.733G presentes en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 se encuentran en cis, formando parte de un alelo RHCE*ce(c.48C, c.733G) (haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G)) o formando parte de los haplotipos RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.48C) o RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.733G) en trans con los haplotipos RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.733G) o RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.48C), respectivamente, se analizó la presencia de los SNVs c.48C y c.733G en 304 muestras de ADN con una deleción homocigota del gen RHD. Este estudio mostró una baja asociación entre el alelo RHD*01N.01 con los polimorfismos c.48C y c.733G. El 2,30% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.733G y el 2,96% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.48C. Ninguna de las muestras analizadas fue portadora de ambos polimorfismos concomitantemente. Estos hallazgos sugieren que en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 los polimorfismos c.48C y c.733G se encuentran en cis formando el haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G). Para evaluar la presencia de otros polimorfismos en el exón 5 del gen RHCE, se realizaron estudios de secuenciación en muestras portadoras del haplotipo RHD*01N.01-RHCE*ce(733G). Los resultados mostraron que este polimorfismo fue detectado en estado heterocigota en todas las muestras analizadas, sugiriendo que el alelo RHCE hallado es RHCE*ceVS.01. Los resultados obtenidos en los estudios de asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE permitieron detectar desequilibrios de ligamiento que involucran a las variantes RHD*DEL43, RHD*D débil tipo 1 y RHD*D débil tipo 4 con alelos RHCE responsables de expresiones alteradas de los antígenos c, E y e. La identificación de variantes RHCE por métodos moleculares permite superar las limitaciones de las técnicas serológicas convencionales que no detectan expresiones aberrantes de los antígenos c, E y e en muestras que portan una copia normal del gen RHCE en trans. La detección de estos polimorfismos del gen RHCE por métodos moleculares permite prevenir eventos de aloinmunización cuando las variantes RHCE*ce.37 y RHCE*ce (48C, 733G) se encuentran en trans con los alelos normales RHCE*Ce, RHCE*Ce o RHCE*CE. En este trabajo de Tesis se validó una nueva estrategia molecular (PCR multiplex cuantitativa de fragmentos cortos fluorescentes: PCR-QMPSF) para investigar el número de copias de todos los exones, tanto del gen RHD como RHCE. Inicialmente se estudió un grupo de muestras portadoras de genes normales y genes híbridos D-CE con genotipos conocidos para validar su utilidad y robustez. A través de esta estrategia logramos caracterizar 4 variantes alélicas RHD, identificando 3 alelos nulos, RHD-RHCE(3-9)-D (n=2), RHD*01N.07 y un alelo D parcial RHD*DVI tipo 4, de una forma mucho más rápida, menos laboriosa y disminuyendo el error asociado al operador. Sin embargo, se trata de una metodología costosa que debe ser empleada criteriosamente. Esta estrategia presenta muchas ventajas, incluido el hecho de que la reacción se lleva a cabo en un formato de tubo cerrado, reduciendo así la exposición química de los operadores a compuestos potencialmente nocivos. El método aprovecha el etiquetado fluorescente universal, que utiliza un solo cebador conjugado con marcación fluorescente para etiquetar todos productos de PCR, contribuyendo así a reducir el coste de los reactivos. Finalmente hemos investigado las bases moleculares responsables de la expresión alterada de los antígenos RhCE en 4 donantes de sangre, logrando caracterizar la estructura molecular de los alelos responsables. Se estudió un grupo familiar donde se observó una discrepancia en la herencia de los antígenos RhCE. Los resultados moleculares obtenidos han permitido demostrar la presencia de un nuevo haplotipo nulo RHD*08N.01- RHCE*01.16(807G). Cabe señalar que tanto los alelos RHD como RHCE en este haplotipo son silenciados por el mismo SNV c.807T>G, posiblemente como consecuencia de la recombinación homóloga entre las secuencias RHD y RHCE. Esta sustitución nucleotídica es responsable de la generación de un codón de terminación prematuro y proteínas Rh truncas que no se integran en la membrana del eritrocito. Estudios previos (118, 107, 178, 179) han reportado que el mismo codón de terminación generado por la mutación en la posición nucleotídica 807 es responsable de 9 alelos RH silentes (8 RHD y un alelo RHCE). Teniendo en cuenta todos estos hallazgos resulta lógico suponer que esta posición en la secuencia de ADN presenta una inestabilidad inherente susceptible a adquirir mutaciones debido a una alta tendencia a la conversión génica o a sustituciones de nucleótidos simples. El análisis de segregación familiar mostró que este haplotipo se heredó por vía materna. Por otro lado, se investigó la presencia de la inserción de 4 pb en el exón 8 del gen RHD en muestras portadoras del gen RHD*08N.01, previamente genotipificadas en nuestro laboratorio. La estrategia QMPSF permitió demostrar que en nuestra población todas las variantes RHD*08N.01 halladas muestran un desplazamiento de 4pb en el exón 8 del gen RHD, lo cual constituye un nuevo polimorfismo que podría ser utilizado para la caracterización del pseudogen RHDΨ. Finalmente, se identificaron los mecanismos moleculares responsables de fenotipos con deleción parcial de los antígenos RhCE en 3 donantes. En una muestra se halló una mutación puntual (c.659G > A) que genera un codón de terminación prematuro y una proteína trunca RhCE incapaz de integrarse en la membrana del eritrocito (fenotipo D--). En las otras dos muestras estudiadas se detectaron nuevos alelos híbridos RHCE-D-CE responsables no solo de los fenotipos D- - y Dc- sino también de la sobreexpresión de antígeno D y de la expresión de un antígeno c variante, respectivamente. En este trabajo de Tesis evidenció que distintos mecanismos moleculares pueden ser responsables de un mismo fenotipo con deleción parcial de los antígenos RhCE (D--). En todos los casos estudiados se brindó asesoramiento genético a los donantes en caso de requerir transfusiones o cursar embarazos a lo largo de su vida. Las estrategias moleculares diseñadas en este trabajo de Tesis permitieron profundizar los conocimientos sobre los eventos genéticos responsables de la expresión variante de los antígenos del sistema Rh. Hemos demostrado que los estudios serológicos no son suficientes para identificar todas las variantes antigénicas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis establecen la importancia del estudio del polimorfismo molecular del locus RH, para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RH y optimizar la selección de unidades hemocompatibles en los servicios de medicina transfusional.
Descentralización de la dispensación de antirretrovirales hacia el Primer Nivel de Atención: un recorrido desde 1995 a 2019, desde la perspectiva de los profesionales del subsector público de la red de salud municipal de la ciudad de Rosario
(2022) Mehring, Silvana; Colautti, Marisel
La irrupción del VIH-sida planteó grandes desafíos para las redes y servicios de salud. Los tratamientos antirretrovirales de gran actividad (TARGA) marcaron la diferencia en la vida de las personas que viven con VIH-sida (PVVS) y permitieron convertir el problema de salud en una condición crónica. Sin embargo, para lograr la cronicidad es imprescindible que las redes y servicios de salud descentralicen la atención y fortalezcan el primer nivel de atención (PNA). El subsistema público municipal de la ciudad de Rosario hace más de dos décadas que lleva adelante una entrega descentralizada TARV siguiendo los lineamientos de la política de salud pública local. En este marco la pregunta que moviliza el trabajo es: ¿Cómo se dieron los procesos de descentralización de TARV hacia el PNA en la red de Salud Pública de la Municipalidad de Rosario? El objetivo general es caracterizar el proceso de descentralización de la dispensación de TARV en la Red de Salud Pública Municipal a partir del año 1995 hasta el año 2019, desde la perspectiva de los profesionales involucrados en el proceso. Estudio de abordaje cualitativo, exploratorio y retrospectivo. Se utilizaron fuentes de información primaria: entrevistas semi estructuradas a referentes de la problemática del VIH-sida a nivel local, y secundaria: diversos documentos y sistema informático local, Sistema de Información en Salud de Rosario (SISR). La información se sistematizó y analizó en una matriz de datos. Los resultados lograron describir diferentes etapas por las que atravesó la atención de las PVVS y el proceso de descentralización sostenido de la dispensación de ARV hacia el PNA durante el período de estudio. Todos los entrevistados acuerdan en señalar que el gran facilitador del proceso fue la política sanitaria local. Se encontraron puntos de tensión y de consenso, así mismo facilitadores y obstáculos para el avance de la implementación de dicha descentralización, ya que la misma sucedió en forma muy temprana, si se la compara con otras redes nacionales e inclusive internacionales. Se pone al territorio en el centro de la discusión como espacio donde todo confluye: decisiones políticas de los diferentes niveles jurisdiccionales, distintas necesidades de la población y características de las personas que conforman esas redes que contienen y sostienen el funcionamiento y la dinámica cotidiana. El trabajo logra poner en evidencia que, para entender procesos tan complejos, donde intervienen diferentes actores y convergen políticas sanitarias de distintos niveles y jurisdicciones, es imprescindible recurrir a estrategias de investigación cualitativa.
Identificación de variante genética causal para síndromes de cáncer colorrectal hereditario; secuenciación masiva en paralelo y aplicación de herramientas bioinformáticas
(Facultad de Ciencias Agrarias-Universidad Nacional de Rosario, 2023) Mayordomo, Andrea Constanza; Turjaski, Adrián; Murillo, Javier
El cáncer colorrectal (CCR) tiene una elevada incidencia y mortalidad a nivel mundial y en Argentina es la segunda causa de muerte por cáncer (10,6%). Los Síndromes de CCR hereditario se dividen en Cáncer Colorrectal Hereditario No Polipósico (CCHNP) y síndromes de Poliposis, siendo el síndrome de Lynch (SL) y la Poliposis Adenomatosa Familiar (PAF) las formas de CCR hereditario más comunes. La utilización de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS) para guiar la prevención, el diagnóstico y el tratamiento de enfermedades basadas en los genes individuales de una persona o una familia, su medio ambiente y su estilo de vida, se conoce con el nombre de medicina de precisión. A pesar de este nuevo paradigma de la Medicina de Precisión son pocos los reportes y la aplicación de estas técnicas en América Latina. Particularmente, el grupo de investigación REM-ProCanHe del cual formo parte, lleva adelante desde 1996 el desarrollo de investigación clínica para la identificación temprana de CCR en pos de alcanzar la medicina de precisión. La vinculación internacional de este grupo con especialistas en la temática de la universidad de Helsinki (Finlandia) ha permitido realizar técnicas de secuenciación masiva en paralelo en muestras argentinas. El objetivo general del presente trabajo fue aplicar herramientas bioinformáticas para realizar un análisis preciso y rápido con el objetivo de identificar a nivel germinal la variante causal asociada con aumento de susceptibilidad a desarrollar CCR hereditario, partiendo de resultados genómicos derivados de secuenciación de nueva generación. Se estudiaron 21 casos de pacientes clínicamente diagnosticados con síndrome de Poliposis provenientes del Registro de Poliposis Adenomatosa Familiar del Hospital de Gastroenterología Dr. Carlos Bonorino Udaondo. Se analizaron de manera secuencial por i) secuenciación con el método de Sanger del exón 15 del gen APC (directamente relacionado con PAF); ii) luego con la técnica de MLPA para evaluar presencia de grandes rearreglos; iii) finalmente, para aquellas muestras aun negativas sin alteración genética-causal identificada (mediante métodos i y ii) se realizó la secuenciación del exoma completo. Como resultado, a través de la técnica de secuenciación por Sanger, en 6 casos identificamos la variante genético causal en el gen APC, siendo todas variantes novel, las cuales podrían ser verificadas a nivel funcional por otras técnicas o incorporar mayor información genética ya sea de muestras de la familia en estudio u otras muestras independientes que presenten la misma variante. Además, para otros 4 casos y mediante la secuenciación del exoma completo pudimos identificar la variante genético-causal candidata para predisposición en genes con asociación establecida para la patología. Específicamente, 2 casos presentaron alteración en genes relacionados con la patología, pero por el fenotipo clínico no pudieron confirmarse como genético-causal. Los otros 2 casos presentaron variantes en dos genes que se relacionan con el funcionamiento homeostático del intestino por lo cual necesitamos mayor evidencia sobre los mismos para poder adjudicarlos como genético-causal. Po otra parte, no encontramos genes que se relacionan directamente con el fenotipo en 7 casos los cuales todavía siguen en estudio. A partir de los datos obtenidos en este trabajo, se evidenciaron los parámetros, los pasos a seguir para llevar el resultado obtenido desde el secuenciador hasta el archivo VCF, como así también el diseño de un pipeline para la priorización de variante. Se espera que las herramientas y procedimientos obtenidos en el presente trabajo contribuyan de manera significativa en la medicina de precisión posibilitando el desarrollo de nuevas estrategias para el estudio del Síndrome de CCR hereditario.
Ensamblado y análisis comparativo de metagenomas de rumen vacuno
(Facultad de Ciencias Agrarias-Universidad Nacional de Rosario, 2022) Ricardi, Laura Lis; Blancato, Víctor
Los rumiantes pueden transformar la energía almacenada en las plantas en productos alimenticios que pueden ser utilizados por los humanos, como la carne y la leche. La microbiota del rumen está compuesta por protozoos, bacterias, hongos y arqueas, que son responsables de la degradación del material vegetal. A pesar del fuerte interés industrial y científico, el rumen sigue siendo un hábitat poco conocido, con muchas especies y cepas microbianas no cultivadas. La secuenciación metagenómica del rumen produce secuencias muy novedosas, que pueden ser de gran interés para las industrias de biocombustibles, alimentos y biotecnología. En este trabajo, los metagenomas de muestras de rumen fueron obtenidos de vacas regionales jóvenes y adultas alimentadas con una dieta rica o pobre con el objetivo de ensamblar nuevos genomas. El ADN fue extraído y secuenciado por WGS. Luego, las lecturas se filtraron por calidad y se ensamblaron con Megahit. La calidad de los contigs se evaluó con el software QUAST, y BWA MEM se usó para asignar lecturas a los ensamblajes. El binning se realizó con Metabat2 usando los contigs obtenidos, y archivos BAM correspondientes a alineaciones de lecturas. Se recuperaron de 12 a 31 bins por muestra, y se evalúo su integridad y contaminación mediante CheckM. El filtrado de estos por completitud ≥80% y contaminación ≤10%, generó entre tres y cinco genomas ensamblados de metagenomas (MAGs) por muestra. La asignación taxonómica se llevó a cabo utilizando el servidor MiGA, lo cual permitió identificar organismos asociados al tracto gastrointestinal y la degradación de material vegetal. La predicción de genes se llevó a cabo mediante Prodigal. Con esta información, se determinó el perfil metabólico utilizando el programa Genomaple, el cual permitió obtener un análisis global de las principales vías presentes en los metagenomas. Debido a la importancia de las enzimas activas sobre carbohidratos (CAZymas) en el rumen, se realizó un estudio de las CAZymas presentes en las muestras, identificándose posteriormente aquellas enzimas no ortólogas a la base de datos de proteínas ruminales RumiRef, lo cual sugeriría que estas proteínas son únicas en las muestras analizadas
Análisis de la farmacoterapia de un paciente VIH+ en tratamiento antirretroviral
(2022) Biscay, Alexis Fernando; Brandoni, Anabel
Objetivo: Realizar una evaluación de la farmacoterapia y analizar los Problemas Relacionados con los Medicamentos (PRM) en un paciente portador de VIH con antecedentes de múltiples esquemas antirretrovirales. Método: Se seleccionó un paciente de sexo femenino, 44 años con diagnóstico VIH positivo (VIH +) desde junio de 1993 con importante lipodistrofia y antecedentes de estar expuesto a múltiples esquemas antirretrovirales, registrado en el sistema de gestión de pacientes de la Dirección de Sida y Enfermedades de Transmisión Sexual (DSyETS) denominado SVIH. Se realizaron dos entrevistas al paciente donde, con el consentimiento de éste, se hizo un análisis retrospectivo de su historia terapéutica. Se analizaron los diferentes esquemas antirretrovirales evaluando los medicamentos administrados, dosis y duración del tratamiento. Posteriormente se realizó un análisis para detectar PRM. Resultados: Se realizó un análisis farmacoterapéutico retrospectivo a través de la historia clínica de una paciente ambulatoria VIH (+). Se detectaron algunos problemas relacionados a los medicamentos: PRM tipo 1, la paciente utilizaba esquemas antirretrovirales con menos fármacos que los recomendados, la recomendación actual es un mínimo de tres fármacos activos, es decir fármacos a los cuales el virus no haya generado resistencia; y PRM tipo 6 debido a la utilización de fármacos antirretrovirales con efectos adversos agudos y crónicos, algunos, como por ejemplo Zalcitabina no recomendados al día de hoy por su alta toxicidad, durante el historial terapéutico de la paciente. Conclusión: En función de los PRM detectados y teniendo en cuenta los problemas de adherencia que manifestó la paciente durante su historial terapéutico, en este trabajo se propone la posibilidad de administrar un nuevo tratamiento antirretroviral superador que podría evaluarse con el equipo médico que sigue a la paciente para tratar de mejorar tanto la adherencia como la calidad de vida de la paciente. Este nuevo esquema tendría que estar formado por fármacos que tengan menor capacidad para generar desórdenes metabólicos.
El taller como herramienta didáctica para el aprendizaje acerca del consumo de sustancias psicoactivas en estudiantes secundarios
(2023) Biolatto, Silvana M.; Drogo, Claudia; Pacchioni, Alejandra María
El taller es una estrategia de enseñanza donde se aprende realizando actividades, en las escuelas secundarias es cada vez más necesario tratar realidades como el consumo de sustancias psicoactivas (SPs). En la EETP N° 288 Dr. Osvaldo Magnasco de la ciudad de Rosario, se implementó un taller en 2021. El objetivo fue evaluar el taller como herramienta didáctica para el aprendizaje sobre SPs en estudiantes secundarios. Se trabajaron distintas SPs y su impacto a largo plazo por medio de una dinámica de taller, qué constó de dos actividades. Para conocer los saberes previos de los estudiantes y el impacto del taller sobre los mismos se implementó un cuestionario antes y después del taller. Se observó un aumento en el reconocimiento de la producción de adicción de las SPs más comúnmente consumidas por los adolescentes; en la identificación de que el consumo de SPs puede producir problemas legales y económicos además de los de salud, así como en mencionar a la familia y la escuela como los lugares donde tratar el tema. El taller favoreció la construcción de conocimiento sobre las SPs. La aplicación de un cuestionario permitió cuantificar los saberes, revelando el impacto del taller como herramienta didáctica.
Bacteriemias a Staphylococcus aureus meticilino resistentes. Perfiles de susceptibilidad antibiótica y búsqueda de cepas hVISA y VISA
(2023) Falco, María Gabriela; Pérez, Jorgelina; Negro Marquínez, Liliana
Staphylococcus aureus es capaz de producir desde infecciones cutáneas y de mucosas relativamente benignas hasta enfermedades de riesgo vital como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis y neumonía. Cualquier localización de la infección puede transformarse en invasiva y terminar en bacteriemia. El tratamiento de elección para las infecciones a estafilococos son los antibióticos betalactámicos. La resistencia a meticilina confiere resistencia a todos los betalactámicos a excepción de las cefalosporinas de última generación como ceftarolina y usualmente se acompaña de resistencia a otras familias de antibióticos. La problemática de multirresistencia observada en estos aislamientos, obligó a enfocar el tratamiento empírico de este tipo de infección al uso de antibióticos no betalactámicos, como vancomicina. En la década del 90 debido al uso extendido de vancomicina surgieron cepas con sensibilidad disminuida como consecuencia de una serie de mutaciones secuenciales que conducen a alteraciones en el metabolismo de la pared celular bacteriana. Las cepas VISA se definen como aquellas que presentan una CIM (concentración inhibitoria mínima) a vancomicina de 4-8 μg/ml. Las cepas de S. aureus con resistencia heterogénea (hVISA) presentan CIM de sensibilidad a vancomicina, en su mayoría de 2 μg/ml, pero contienen subpoblaciones que pueden crecer en presencia de concentraciones de vancomicina ≥ 4 μg/ml a una frecuencia de 10−5 -10−6 , por lo que no son detectadas por los métodos de rutina estandarizados. Las prevalencias de estas cepas tuvieron un incremento a lo largo del tiempo, lo que demuestra la importancia de su detección ya que generan fallas de tratamiento con glicopéptidos aumentando el tiempo de hospitalización, la persistencia de la infección y elevando los costos. El gold estándar para la detección de cepas VISA y hVISA es el análisis de perfil poblacional-área bajo la curva (PAP-AUC) pero es un método muy laborioso. Existen otras metodologías descriptas para el estudio de estas cepas como predifusión con tabletas NeoSensitabs (Rosco), Macro Etest y placas de screening en agar BHI con distintas concentraciones de vancomicina. El presente trabajo tiene como objetivos evaluar los aspectos clínicos de los pacientes con bacteriemia a Staphylococcus aureus meticilino resistentes (SAMR) de la sala de clínica del Hospital Provincial del Centenario desde marzo de 2020 a marzo de 2022, el perfil de susceptibilidad de los aislamientos comparando con los resultados obtenidos en un estudio previo realizado entre 2014 y 2018 y determinar si estas cepas presentan fenotipo hVISA y VISA utilizando principalmente como metodología de screening la predifusión con tabletas de vancomicina y teicoplanina debido a altos valores de sensibilidad y especificidad junto con un buen valor predictivo negativo; adicionando el macro Etest y screening con placas de agar BHI con distintas concentraciones de vancomicina en aquellos pacientes con bacteriemia persistente con tratamiento a base de glicopéptidos por más de 15 días. En los 66 pacientes incluídos en el presente estudio las enfermedades de base halladas con mayor frecuencia fueron hipertensión arterial, diabetes, insuficiencia renal crónica y enfermedades oncohematológicas. Los factores de riesgo más frecuentes fueron la presencia de catéter seguido por hemodiálisis. En cuanto a la clasificación de los 69 episodios de bacteriemias según la duración un 72% fueron intermitentes, 23% continuas y 4% transitorias; según su origen, un 36% de bacteriemias fueron de la comunidad, 42% intrahospitalaria y 22% asociada a cuidados de la salud. Respecto al foco microbiológico documentado principalmente se observó que el 46 % corresponde a infecciones de piel y partes blandas y el 17% asociado a la presencia de catéter (dentro del cual un 67% a catéter venoso central y un 33% a catéter de hemodiálisis). El tratamiento empírico con monoterapia a vancomicina se utilizó en 17 de 69 episodios de bacteriemias; el tratamiento combinado con vancomicina en 35, en 5 se utilizó un tratamiento antibiótico que no incluía glicopéptidos y en 12 de 69 episodios se desconoce el tratamiento empírico utilizado. El tratamiento dirigido se basó en monoterapia con vancomicina en 54% de bacteriemias y tratamiento combinado en 29% de los cuales 40% fueron combinaciones de vancomicina con β-lactámico y 60% con otras familias de antibióticos principalmente linezolid. Del total de pacientes analizados, 67% tuvieron buena evolución con resolución del cuadro mientras que 23% pacientes fallecieron y en 11% se desconoce la evolución. De los pacientes con evolución favorable 64% fueron tratados con monoterapia a vancomicina, 36% con tratamiento combinado y en 5% pacientes se desconoce el tratamiento instaurado. En cuanto al perfil de susceptibilidad de los 115 aislamientos estudiados se observa un 73% de sensibilidad a gentamicina, 87% a ciprofloxacina, 93% a levofloxacina, 97% a tetraciclina y trimetoprima sulfametoxazol, 96% a rifampicina, 73% a eritromicina, 72% a clindamicina. El 17% de los aislamientos presentan mecanismo MLSi (macrólidos lincosamidas estreptograminas inducible). La totalidad de los aislamientos son sensibles a linezolid, minociclina, teicoplanina, daptomicina y vancomicina. La CIM promedio a vancomicina es de 1 µg/ml. Para evaluar cambios en la susceptibilidad antibiótica de los aislamientos a lo largo del período estudiado, se categorizó el mismo en distintos bloques de tiempo evaluando mediante el test de independencia de Fisher con un nivel de significación p-value<0.05. Considerando períodos de un año y seis meses, no se observaron modificaciones en la susceptibilidad, pero al dividir el tiempo en períodos de 5 meses se vieron cambios significativos en la resistencia a gentamicina; donde el mayor porcentaje de resistencias se asoció al período comprendido por los meses de junio a octubre de 2021. Se estudio la posible asociación de la resistencia en SAMR con el origen de la bacteriemia para cada antibiótico (comunidad, asociada a cuidados de la salud e intrahospitalaria), utilizando el test exacto de Fisher considerado estadísticamente significativo para p-value<0.05 se obtuvieron los resultados con un aumento estadísticamente significativo en la resistencia a clindamicina para las bacteriemias intrahospitalarias. Para la búsqueda de cepas hVISA y VISA se pusieron a punto las metodologías con las cepas de referencia Mu3 y Mu50 (hVISA y VISA respectivamente). Mediante sistema automatizado Vitek 2C (Biomérieux) se observó en la cepa Mu50 el alerta de la presencia de cepas VISA ya que presentan una CIM a vancomicina entre 4-8 µg/ml. Los resultados del sistema automatizado para la cepa Mu3 indican sensibilidad a vancomicina (CIM ≤2 µg/ml) con un alerta de fenotipo para revisión hVISA. En las cepas clínicas estudiadas no se observa presencia de hVISA y VISA según esta metodología. Por predifusión a vancomicina y teicoplanina con discos Neo-Sensitabs Rosco se obtuvo para los 115 aislamientos clínicos de 66 pacientes se obtuvo un promedio de halo de inhibición de vancomicina de 28 mm y teicoplanina de 29 mm lo que indica que ninguno presentó fenotipo hVISA y VISA según este ensayo. La metodología de Macro Etest estandarizada con la técnica de Howden y col. con las cepas de referencia se utilizó en 6 aislamientos de bacteriemias persistentes con tratamiento con vancomicina por más de 15 días obteniendo valores de CIM de 1,5 µg/ml (cepa 22545), 2 µg/ml (cepa 24720), 3 µg/ml (cepa 30612), 1 µg/ml (cepa 43723), 3 µg/ml (cepa 46240) y 1,5 µg/ml (cepa 47138). En estos 6 aislamientos también se aplicó la metodología de screening en placas de agar BHI con distintas concentraciones de vancomicina sin observarse desarrollo en las placas confirmando que los fenotipos corresponden a Staphylococcus aureus sensible a vancomicina (VSSA). Debido a que mediante las metodologías de screening aplicadas a los aislamientos clínicos no se obtuvieron fenotipos hVISA y VISA no se realizó la técnica gold estándar de PAP-AUC. En conclusión se mantienen las enfermedades de base más frecuentes, como insuficiencia renal crónica y diabetes al comparar el presente estudio con el realizado entre 2014 y 2018, sin embargo se observa un incremento en hipertensión arterial y enfermedades oncohematológicas. En cuanto a los factores de riesgo en ambos estudios, y como es característico en las bacteriemias a SAMR, predomina la presencia de catéter. En lo que respecta a la clasificación de las bacteriemias según su duración prevalecen las intermitentes relacionadas al predominio de foco microbiológico de infecciones de piel y partes blandas, seguido por las continuas relacionadas a infecciones asociadas a catéter dentro de las cuales se destaca la presencia de catéter venoso central en relación a catéter de diálisis. En el caso de la clasificación según el origen de la bacteriemia se observan modificaciones con aumento en la frecuencia de las intrahospitalarias en relación al período 2014-2018 donde se observaba un predominio de las originadas en la comunidad. Este cambio puede deberse a la situación epidemiológica transitada durante los años 2020 y 2021 aumentado las hospitalizaciones y duración de las mismas. Se destaca en nuestro nosocomio la preferencia del tratamiento empírico combinado con glicopéptidos respecto a la monoterapia con vancomicina. Esta relación se invierte cuando se instaura el tratamiento dirigido donde predomina la monoterapia a vancomicina ajustando la terapéutica según antibiograma del aislamiento. La mayoría de los pacientes tuvieron buena evolución solucionando el cuadro clínico, dentro de este grupo predominan los pacientes tratados con monoterapia a vancomicina. Analizando la susceptibilidad antibiótica de los aislamientos SAMR de bacteriemias de nuestro nosocomio a lo largo del tiempo, comparando el trabajo realizado entre el 2014 y 2018 con este estudio, se puede concluir que el perfil de susceptibilidad a los antibióticos ensayados no se modificó para las cepas estudiadas. Al dividir las susceptibilidades antibióticas del presente estudio en períodos de 5 meses vemos que la gentamicina sufrió un cambio estadísticamente significativo, siendo el único antibiótico con modificaciones a lo largo del período evaluado principalmente en el período comprendido entre los meses de junio a octubre de 2021. En la búsqueda de cepas hVISA y VISA utilizando sistemas automatizados como Vitek 2C se obtienen resultados confiables para VISA, pero en el caso de hVISA se deben poner a punto otras metodologías de screening para su búsqueda. Por este motivo y basándose en los estudios previos donde se observa alta sensibilidad y especificidad junto con un buen valor predictivo negativo, se utilizó la predifusión a vancomicina y teicoplanina como herramienta principal en la detección de estas cepas. En el período estudiado no se observaron aislamientos con estos fenotipos, corroborando este resultado por metodología de macro Etest y screening con placas de BHI con distintas concentraciones de vancomicina, en los pacientes con tratamiento prologado con vancomicina por más de 15 días. El presente estudio permitió poner a punto metodologías para la pesquisa activa de aislamientos clínicos con fenotipo VISA y hVISA. En agosto de 2022 se aisló un SAMR de una bacteriemia de un paciente de unidad coronaria que mediante ensayos de screening se determinó la presencia de fenotipo hVISA. Para confirmar los resultados obtenidos por las metodologías de screening se realizó el PAP-AUC, obteniendo una relación de áreas entre el aislamiento del paciente y la cepa Mu 3 mayor a 0.9 verificando el fenotipo hVISA.
Didáctica de la solubilidad y las soluciones químicas en la educación secundaria
(2022) Médica, Vanesa Aylén; Calviño, Néstor Gabriel
El presente Trabajo Final se centra en el abordaje de la didáctica de la solubilidad y las soluciones químicas en la educación secundaria como tema de investigación. Específicamente busca abordar la experimentación en el laboratorio de química como estrategia didáctica para favorecer la comprensión de los conceptos de soluto, solvente y dilución y su reconocimiento y aplicación en el proceso de preparación de soluciones. La intención de abordar este tema surge de haber detectado durante las prácticas de laboratorio de Química Analítica General (unidad curricular de 5° año de la Tecnicatura en Química del nivel secundario en Rosario), específicamente en lo que respecta a las prácticas de preparación de solución y diluciones, que los estudiantes encuentran serias dificultades para reconocer y aplicar los conceptos de soluto, solvente y dilución aprendidos en años anteriores. Se ha observado sistemáticamente que una de las principales dificultades de los estudiantes es la comprensión de conceptos con un alto nivel de abstracción, como los que aquí se pretenden abordar. Esto encuentra correlato con lo observado por Laudau, Ricchi, Torres (2014) que plantean que el concepto de “disoluciones” trae aparejada una dificultad en su comprensión por parte de los estudiantes del ciclo básico si su enseñanza no es acompañada de otras estrategias didácticas por fuera de la exposición teórica. En este mismo sentido, Muñoz y colaboradores en el trabajo “Estudio sobre la problemática del aprendizaje de las disoluciones en el nivel universitario” (2006) realizaron un estudio para evaluar las dificultades que tienen los estudiantes para interpretar el tema disoluciones en relación con deficiencias en la comprensión del concepto de solubilidad y concentración. Además, teniendo en cuenta la experiencia pedagógica y didáctica en el establecimiento, se acuerda con Oliveros (2013) quien plantea que los estudiantes presentan dificultades para describir el proceso de disolución sin tener en cuenta los diferentes tipos de interacciones. Este tipo de dificultades profundizan las representaciones internas erróneas, forzando también aprendizajes memorísticos. Por último, en relación al tipo de enseñanza adoptada para la química en general, Buitrago sostiene que la enseñanza tradicional y principalmente teórica fomenta una actitud pasiva por parte del estudiante frente al conocimiento lo cual genera, según el autor, dificultades “en la comprensión de los conceptos básicos relacionados con las temáticas relacionadas con las soluciones químicas, lo cual afecta la comprensión de otras temáticas y se refleja en los malos resultados de las pruebas externas e internas.” (2012, p. 16) Por tanto, la problemática que se busca abordar con este trabajo refiere a la dificultad de los estudiantes en apropiarse significativamente de los conceptos de soluto, solvente, dilución, y para su abordaje se formularon las siguientes preguntas disparadoras: ¿cómo puede mejorarse el aprendizaje de los conceptos de soluto, solvente y dilución?, ¿qué ocurre con el aprendizaje cuando debe pasarse del plano real al abstracto?, ¿por qué no logra ser significativo el aprendizaje de los conceptos mencionados?, ¿qué relación existe entre el plano “abstracto” del tema y la dificultad en el aprendizaje? OBJETIVOS En relación a la problemática del aprendizaje significativo se propone como objetivo general de este trabajo, evaluar el impacto de la experimentación en el laboratorio de química en el aprendizaje significativo de los conceptos de soluto, solvente y dilución. Para alcanzar este objetivo general, se formularon los siguientes objetivos específicos: ● Analizar y problematizar las relaciones entre soluciones (soluto y solvente) y factores de dilución en los planos real y abstracto de la Química. ● Diseñar una estrategia didáctica para promover la comprensión de los conceptos de soluto, solvente y dilución y su contextualización en la preparación de soluciones en el laboratorio de Química. ● Evaluar la apropiación de los conceptos de soluto, solvente y dilución por parte de los estudiantes
Identificación y caracterización de bacterias utilizables en procesos de biorremediación de ambientes contaminados con compuestos utilizados en la agricultura
(2023) Masotti, Fiorella; Ottado, Jorgelina; Gottig, Natalia
Los herbicidas de amplio espectro basados en glifosato (GP) (del inglés “Glyphosate Based Herbicides”, GBH) se han convertido en los más utilizados a nivel mundial. El GP (C3H8NO5P) es un miembro del grupo de compuestos químicos denominados fosfonatos, caracterizados por poseer el enlace carbono-fósforo (C-P). El uso extensivo de GBH, ha provocado que residuos de GP y de su principal metabolito de degradación, el ácido amino metilfosfónico (AMPA); se encuentren ampliamente distribuidos en el ambiente. Con la necesidad de prevenir la contaminación de los ambientes naturales y de buscar alternativas para su control y tratamiento, la biorremediación se ha considerado como una de las tecnologías más eficientes. En este contexto, en este trabajo de Tesis, se han aislado bacterias capaces de degradar el GP a partir de suelos de la provincia de Santa Fe con historia de repetidas aplicaciones con este herbicida. De un total de 62 aislamientos bacterianos con capacidad de crecer en presencia GBH como única fuente de fósforo, encontramos 13 especies diferentes pertenecientes a los géneros: Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium, Ochrobactrum, Pseudomonas y Pantoea. Se han caracterizado los perfiles de degradación del GP, GBH y AMPA de estos aislamientos bacterianos y la mayor eficiencia de degradación, se observó para las bacterias de los géneros Achromobacter, Agrobacterium y Ochrobactrum. El genoma de Agrobacterium tumefaciens CHLDO, seleccionada por ser una de las cepas que más eficientemente degrada el GBH, se secuenció y reveló la presencia de un grupo de genes phn (phnFGHJIKLOCDE2E1-duf1045phnNM), responsable de la metabolización de fosfonatos a través de la vía C-P liasa. El análisis de la expresión de los genes phn de A. tumefaciens CHLDO al crecer en presencia de GBH, o fosfato inorgánico como únicas fuentes de fósforo, mostró una inducción del cluster phn en presencia del herbicida, lo que sugiere una fuerte participación de esta vía en la degradación del GP. Además, la introducción de este cluster phn de A. tumefaciens CHLDO en el chassis heterólogo derivado de Pseudomonas putida KT2440, modificado para ser un auxótrofo de glicina (GLY), denominada SLTB7, permitió estudiar la degradación del GP a través de la vía C-P liasa. Dado que la GLY es un subproducto de la degradación de GP por esta vía, se ha desafiado a la degradación del GP acoplada al crecimiento bacteriano. La sobreexpresión del cluster phn demostró que la cepa SLTB7 es capaz de tolerar más el efecto de inhibición del crecimiento dado por el GP que la cepa control, aunque no es suficiente para revertir el fenotipo de auxotrofía. También se estudió la enzima blanco para el GP, conocida como EPSPS, de A. tumefaciens CHLDO (EPSPS_CHLDO). Esta enzima es esencial en plantas y microorganismos, por lo que su estudio es fundamental para determinar los efectos producidos por el GP en el ambiente. Se realizó un análisis in silico de las secuencias aminoacídicas de estas enzimas y se demostró que pertenecen a la clase III, tipo resistentes al GP. Además, la sobreexpresión de EPSPS_CHLDO en un plásmido o su inserción en el genoma de P. putida SLTB, generó una cepa más resistente al GP que la cepa parental. Por último, del análisis de los seis posibles promotores asociados al cluster phn de A. tumefaciens CHLDO, se pudo obtener dos biosensores para detectar la presencia de fosfonatos en el medio, basados en la región promotora del gen phnG. Asimismo, se realizó un biosensor que permite la detección de concentraciones de fosfato inorgánico (Pi) en el medio. Este último fue diseñado en base a la región promotora del gen phnC y respondió de manera inversamente proporcional a la concentración de Pi. En resumen, en esta Tesis se han aislado bacterias nativas con alta eficiencia de degradación de GP a partir de muestras ambientales; y los mecanismos moleculares involucrados en este proceso fueron transferidos a cepas bacterianas heterólogas. Los resultados obtenidos sientan las bases para la obtención de herramientas biotecnológicas que permitirán detectar y eliminar este herbicida del medio ambiente.
Virus Zika: desde la emergencia epidemiológica hacia el entendimiento de los mecanismos de patogénesis viral
(2023) Leiva, Santiago Gabriel; Gardiol, Daniela; Bugnon Valdano, Marina Paula
El virus Zika (ZIKV) pertenece al género de los Flavivirus (FV). Como muchos miembros de este género, posee un genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva relativamente pequeño de sólo 11.000 bases, viriones con una envoltura lipídica y un tamaño promedio de 50 nm. Sin embargo, también cuenta con características únicas que lo distingue de otros FV. Durante mi trabajo de tesis doctoral, nos enfocamos en el estudio de los mecanismos relacionados a dos de estas características distintivas de ZIKV. Por un lado, investigamos la gran capacidad de ZIKV de diseminarse dentro de su hospedador. Este virus logra infectar tejidos de difícil acceso para la mayoría de los patógenos humanos, como es el tejido nervioso central. Para lograrlo, debe ser capaz de atravesar complejas barreras biológicas. Sin embargo, los mecanismos que emplea para esto permanecen sin comprenderse completamente. Por lo tanto, decidimos abordar esta incógnita, a través de distintos modelos experimentales. Inicialmente, nos enfocamos en investigar la posibilidad de que ZIKV logre alterar la integridad de las uniones intercelulares (UI) como parte de un mecanismo de patogenicidad que facilite atravesar barreras biológicas por una vía paracelular. Para ello, desarrollamos un modelo de infección in vitro de ZIKV, en colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) “Dr. Julio Maiztegui”, donde obtuvimos acceso a 3 aislamientos virales de ZIKV. Utilizando dicho modelo realizamos ensayos de inmunofluorescencia (IF) para evidenciar cambios en la abundancia y localización de proteínas celulares constituyente de las UI. Seleccionamos a la proteína celular Ocludina como marcador de la integridad de las uniones estrechas y a la proteína DLG1 (del inglés Disc Large 1) como marcador de integridad de las uniones adherentes. Además, para evaluar de forma más precisa y reproducible los cambios que podrían sufrir estas proteínas durante la infección por ZIKV, desarrollamos un algoritmo de cuantificación automatizada de la fluorescencia asociada a la expresión de dichas proteínas celulares, basado en la segmentación de las imágenes. Luego del análisis cuantitativo de imágenes obtenidas a partir de ensayos de IF, observamos una reducción en los niveles de expresión de las proteínas Ocludina y DLG1 tras la infección con distintas cepas virales, aunque sin cambios significativos en la localización subcelular de tales marcadores. Estos resultados nos alentaron a buscar la existencia de mecanismos alternativos o complementarios que podrían influir en la diseminación del virus dentro de sus hospedadores. Por lo tanto, estudiamos la posibilidad de que el virus emplee mecanismos transcelulares de diseminación, en donde manipularía a su favor componentes de las vías secretoras celulares para facilitar su transporte y liberación dentro de la células que componen las barreras biológicas. En este contexto, analizamos factores celulares que podrían estar implicados en las etapas tardías del ciclo de replicación de ZIKV, que hasta el momento resultan poco comprendidas. Para esto, realizamos ensayos de proteómica donde evaluamos los cambios en el proteoma de células humanas en presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV. Esta es la única proteína viral de ZIKV que es secretada al espacio extracelular y se ha reportado que participa tanto en los mecanismos de ensamblaje como de liberación de las partículas virales. Nos enfocamos en buscar posibles proteínas celulares relacionadas a mecanismos de transporte intracelular que hubiesen cambiado su nivel de expresión en presencia de NS1. Interesantemente, encontramos que la proteína celular sinaptotagmina-9 (SYT9) mostró un gran aumento de sus niveles de expresión en presencia de dicha proteína viral. SYT9 es una proteína celular poco estudiada hasta el momento, aunque existen reportes que sugieren que podría ser crucial en mecanismos de transporte intracelulares asociados a vesículas en diversos tejidos. Este hallazgo resultó muy interesante si se contempla que tanto NS1 como los nuevos viriones de ZIKV producidos durante una infección, son liberados de las células mediante transporte vesicular. Por lo tanto, nos propusimos realizar ensayos de microscopia confocal de fluorescencia y Western Blot (WB) para profundizar dicho hallazgo. En este contexto, pudimos demostrar que la presencia de proteínas virales relacionadas a la liberación y ensamblado de los nuevos viriones de ZIKV como son NS1 o la proteína estructural de la envoltura (E), incrementan significativamente la expresión de la proteína celular SYT9. Además, en los ensayos de microscopía confocal de fluorescencia fue posible evidenciar que NS1 y E de ZIKV inducen una fuerte redistribución de SYT9 con un intenso patrón de co-localización con ambas proteínas virales. Además, pudimos reforzar nuestros resultados al demostrar que durante la infección por ZIKV la proteína SYT9 sufre cambios similares a los descriptos anteriormente en relación a su expresión y localización subcelular, mostrando nuevamente una intensa co-localización con las proteínas virales NS1 y E de ZIKV en modelos de infección in vitro. Si bien otros estudios son necesarios para profundizar estos hallazgos, estos resultados son muy importantes dado que es la primera vez que puede asociarse una proteína de la familia de las sinaptotagminas con el ciclo de replicación de los FV. Por otro lado, también decidimos investigar la particular epidemiología de ZIKV. Principalmente, nos abocamos a estudiar las diferencias genéticas existentes entre las cepas de linaje Asiático responsables de las epidemias por ZIKV y las cepas pre epidémicas tanto de linaje asiático como africano (los 2 únicos linajes descriptos para ZIKV). Además, también estudiamos si las cepas epidémicas responsables de los casos asociados a neuropatologías (principalmente microcefalia) poseían variantes genéticas únicas respecto a las demás cepas epidémicas asociadas a casos sintomáticos más leves. Para ello, generamos una base de datos con secuencias genómicas completas de ZIKV que se encontraban disponibles en repositorios digitales. Luego, desarrollamos un algoritmo bioinformático para comparar las secuencias asiáticas epidémicas con los demás grupos, y registrar todas las variantes nucleotídicas así como información relevante asociada a estas variantes, incluyendo: sus posiciones en el genoma, sus consecuencias traduccionales y la frecuencia de cada variante dentro de cada uno de los grupos de secuencias mencionados. Posteriormente, evaluamos la distribución de estas variantes en el genoma de ZIKV para determinar si existían genes con diferente tasa de variabilidad. Además, analizamos en profundidad la frecuencia de cada variante, con el objetivo de encontrar variantes que fueran comunes a todas las secuencias de un determinado grupo de aislamientos de ZIKV. Finalmente, estimamos el impacto de estas mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas virales utilizando como parámetro la variación de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas (ΔΔG) y realizando un modelado proteico de las variables más relevantes epidemiológicamente. De esta manera, logramos identificar varias nuevas variantes genéticas que afectarían la estructura de las proteínas virales y que, a su vez, están presentes en todas las secuencias de los aislamientos epidémicos, pero en ninguna de las secuencias pre epidémicas. Estos datos podrían servir como un importante punto de partida para futuros estudios biológicos para comprender fehacientemente el impacto de estos cambios en las características de las cepas emergentes. En resumen, teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo de Tesis Doctoral podemos concluir que el mismo aporta al conocimiento integral de los mecanismos subyacentes a las particularidades biológicas y epidemiológicas demostradas para un virus con impacto importante en la salud pública regional. Durante este trabajo, fue posible mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos patogénicos que ZIKV utiliza para diseminarse dentro de su hospedador. Además, fue posible identificar potenciales factores celulares que el virus necesitaría para completar su ciclo de vida durante el curso de una infección y que podrían interpretarse como potenciales blancos terapéuticos en futuras investigaciones. Por otro lado, con este trabajo de tesis también hemos aportado a dilucidar las razones por las cuales este virus podría haber logrado desarrollar la última epidemia en América. Esto último nos permite conocer mejor la biología de este virus y sentar las bases para una mejor estrategia preventiva en caso de nuevas emergencias por ZIKV.
Alteraciones moleculares de importancia diagnóstica y pronóstica en Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MFP)
(2022) Ojeda, Mara Jorgelina; Pratti, Arianna Flavia; Calvo, Karina
Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades clonales de la stem cell hematopoyética. Incluyen a policitemia vera, trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (MFP), cuya característica unificadora es la activación constitutiva de la vía de señalización JAK-STAT, impulsada por mutaciones drivers en JAK2, CALR y MPL. Estas mutaciones están directamente implicadas en el fenotipo mieloproliferativo, mientras las mutaciones no drivers, no son específicas de las NMP, pero contribuyen al fenotipo clínico y a la evolución de la enfermedad. La caracterización molecular de las NMP resulta importante tanto en el diagnóstico como en el pronóstico de estas patologías, así como en la identificación de marcadores que podrían ser considerados blancos terapéuticos, lo que representa una necesidad actual, principalmente en MFP. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue investigar la presencia y distribución de mutaciones de importancia diagnóstica en nuestra población de pacientes con TE y MFP, así como de mutaciones de relevancia pronóstica en MFP, contribuyendo así a una mejor caracterización biológica de estas patologías. Para la caracterización de las mutaciones drivers en la cohorte de pacientes con TE (n=258) y MFP (n=69) y de las mutaciones no drivers de High Molecular Risk (HMR) en los genes ASXL1, SRSF2, EZH2 e IDH1/2 en MFP (n=65), se emplearon o diseñaron técnicas de ARMS y ASO-PCR, secuenciación directa, así como también técnicas de screening por (high resolution melting) HRM y por electroforesis en poliacrilamida. Se identificaron mutaciones drivers en 86,4% y 88,4% de la cohorte con TE y MFP, respectivamente. En ambas patologías la mutación más frecuente fue JAK2 V617F (~60%), seguida de las mutaciones de CALR (~20-25%) y por último las de MPL (~5-10%). Las mutaciones HMR se detectaron en el 38,5% de los pacientes con MFP, el 27,7% con 1 y 10,8% con 2 mutaciones. Las mutaciones en ASXL1 (24,6%) fueron las más frecuentes entre los genes de HMR y las segundas más frecuentes, luego de JAK2 V617F. Las mutaciones de SRSF2; EZH2 y IDH2 se detectaron en 15,4%; 7,7% y 1,54% de los casos, respectivamente. La identificación de estas mutaciones en 37,5% de los pacientes triple negativos permitió confirmar la existencia de una proliferación neoplásica mieloide. Por otro lado, se correlacionó el perfil clínico y hematológico de los pacientes al diagnóstico con el estatus de las mutaciones drivers, observándose que la presentación clínica fue más heterogénea en TE que en MFP. En cuanto a las mutaciones de HMR, se asociaron al sexo masculino y a menores valores de hemoglobina. Por último, se analizó la supervivencia global en MFP, con el objetivo de determinar el impacto pronóstico de las mutaciones estudiadas. Las mutaciones de CALR se asociaron con un pronóstico favorable y las mutaciones de HMR en general, e individualmente las de ASXL1, SRSF2 y EZH2, con un pronóstico desfavorable. Los resultados obtenidos subrayan la importancia de la caracterización molecular en el diagnóstico y pronóstico de las NMP, así como también contribuyen a explicar la heterogeneidad clínica de estas patologías.
Caracterización del sistema mec de Staphylococcus aureus: disociación entre la activación y la manifestación de resistencia a β-lactámicos y estrategias para dilucidar el mecanismo de transducción de señal
(2023) Fabbri, Carolina; Llarrull, Leticia I.
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. Su capacidad de tolerar fármacos radica en la producción de una serin-β-lactamasa y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos β-lactámicos. Estos antibióticos inducen la expresión de ambos sistemas (bla y mec, respectivamente). A fin de esclarecer el funcionamiento del sistema mec, estudiamos los eventos moleculares que dan lugar a su activación utilizando cepas de S. aureus reporteras. Confirmamos la transcripción inducible de los genes reguladores del sistema mec, así como también del gen de resistencia. Ensayos con una penicilina fluorescente y de espectrometría de masa mostraron la acumulación de PBP2a en membranas, con capacidad de unir β-lactámicos. Pese a la presencia de PBP2a, la cepa reportera no presentó resistencia. La sensibilidad a los antibióticos β-lactámicos indicó que PBP2a carece de actividad transpeptidasa en dicha cepa. Estos resultados sugieren que la manifestación de resistencia en MRSA no se debe únicamente a la expresión de PBP2a inducida por β-lactámicos, sino a una suma de factores que contribuyen a la capacidad de tolerar estos antibióticos. Además, los estudios realizados mostraron diferencias a nivel de regulación de la transcripción a partir de los promotores divergentes de los genes mecA y mecR1-mecI-mecR2, y con el sistema bla. La proteína sensora/transductora MecR1, detecta al antibiótico presente en el medio e inicia una cascada de señalización que culmina con la manifestación de resistencia. El modelo de MecR1 propone interacciones entre el dominio sensor extracelular y el dominio metaloproteasa integral de membrana que permitirían transmitir la señal al interior celular. Empleamos técnicas de entrecruzamiento molecular para identificar los determinantes estructurales que dan lugar a la transducción de señal. Expresamos variantes modificadas de MecR1 con un aminoácido no-natural fotoactivable en las regiones de interés. Conjuntamente, realizamos entrecruzamiento inespecífico. Establecimos las condiciones de purificación de las proteínas resultantes para su estudio por espectrometría de masa. Si bien no fue posible identificar péptidos entrecruzados, este trabajo sienta las bases para continuar con la caracterización estructural de MecR1 utilizando técnicas de crosslinking. Logramos la sobreexpresión y purificación de MecR1 como fusión a Mistic en micelas de detergente. Abordamos técnicas de cristalogénesis, obteniendo datos preliminares sobre las condiciones de cristalización. Haber sobreexpresado MecR1 en su longitud completa, es uno de los hitos más relevantes de este trabajo. Recientemente se ha publicado la estructura de BlaR1, homólogo de MecR1, que revela un dímero. Con esta información, generamos un modelo de baja resolución para MecR1 en forma dimérica. Nuestro modelo inicial de trabajo correspondía a un monómero. Si bien los ensayos de crosslinking no arrojaron evidencias de que MecR1 forme un dímero, el nuevo modelo permite diseñar otras mutantes puntuales para evaluar, empleando las técnicas aquí puestas a punto, si MecR1 comparte homología estructural y funcional con BlaR1. Esta tesis aporta nuevas perspectivas para continuar con trabajos que permitan dilucidar el mecanismo de transducción de la señal y los requisitos mínimos para la manifestación de resistencia en cepas de MRSA.
Estudio de la vulnerabilidad a cocaína en ratas: implicancias de la vía canónica de Wnt
(2022) Funes, Alejandrina; Pacchioni, Alejandra María; Rosso, Silvana Beatriz
El consumo problemático es una enfermedad neuropsiquiátrica caracterizada por la búsqueda y el uso compulsivo de sustancias psicoactivas (SPs), y por el riesgo permanente de reincidencia aun después de largos períodos de abstinencia. La transición entre el uso ocasional de una SP y el consumo problemático, involucra neuroadaptaciones a largo plazo en el circuito cerebral de la recompensa [1][2]. Esta transición podría comenzar con el uso en individuos vulnerables o en individuos en estados particularmente vulnerables del desarrollo como son los adolescentes [3]. El estudio de la vulnerabilidad individual a los efectos de las SPs, involucra la evaluación de factores genéticos y/o ambientales (como la exposición a situaciones de estrés) que generan un individuo vulnerable. La adolescencia es una etapa particularmente vulnerable al efecto de las SPs, que en los roedores se extiende entre el día post natal (DPN) 28 y el 42 [4]. Resultados recientes de nuestro laboratorio revelaron que el aislamiento social (AS) durante 5 días, entre el DPN 30 y el 35, aumenta la vulnerabilidad a los efectos reforzantes y estimulantes de Cocaína medidos en la adultez en ratas Wistar machos [5]. Uno de los objetivos propuestos en este trabajo de tesis, fue evaluar el impacto del estrés durante la adolescencia tanto a nivel conductual como molecular, así como el rol de la neurotransmisión dopaminérgica en este fenómeno. Para ello, utilizamos el mismo esquema experimental que Cuesta y col (2020)[5], y pudimos determinar que el estrés modifica en formas diferentes la respuesta conductual en ratas machos que hembras. Los resultados obtenidos mostraron que luego de 24hs de finalizado el estrés (DPN36), en los machos aislados se muestra una tendencia a disminuir la actividad locomotora total con respecto a aquellos animales que no fueron estresados. Además, se observó que la administración sistémica de Sulpiride (un antagonista dopaminérgico) revertiría ese efecto. Por otro lado, en el DPN45 las hembras estresadas mostraron una disminución con respecto al control en el tiempo de permanencia en el área central indicando que podría haber un aumento en los niveles de ansiedad. Desde hace más de una década, nuestro laboratorio ha centrado sus estudios en las implicancias de la vía canónica de Wnt sobre la vulnerabilidad a los efectos de Cocaína, tanto a nivel molecular como conductual. Los factores Wnt (del inglés, Wingless-related integration site) [6] son glicoproteínas que funcionan como importantes mediadores de la comunicación intercelular y su participación es crucial para el normal desarrollo embrionario, para el desarrollo del sistema nervioso; y recientemente se ha demostrado que también es crucial para el funcionamiento del cerebro adulto [7][8]. En este sentido, fuimos los primeros en demostrar que la vía canónica de Wnt participaba en la sensibilización inducida por Cocaína [9]. Más aún, demostramos que el estrés disminuye la actividad de la vía canónica de Wnt en la corteza prefrontal (CPF) hasta 10 días después de finalizado el tratamiento [5]. En la presente tesis, exponemos resultados que muestran que, esa disminución en CPF así como su reversión por la administración de Sulpiride es un efecto que ocurriría solo en ratas machos. Resultados de nuestro grupo de investigación indicarían que, la vía canónica de Wnt esta inhibida en la CPF únicamente en animales que desarrollan sensibilización a Cocaína [9]; y que, una inyección de LiCl (Cloruro de Litio) previo a la administración de Cocaína, impide tanto el desarrollo como la expresión de la sensibilización [10]. Evaluados en conjunto, el impacto semejante del estrés y del tratamiento repetido de Cocaína sobre la actividad de la vía canónica de Wnt en la CPF podrían sugerir un rol de esta vía en la vulnerabilidad individual a Cocaína. Por otro lado, ha sido demostrado que la vía Wnt/β-catenina está asociada a la síntesis de mielina, y que la cocaína afectaría la síntesis de mielina en el NAcc [11][12][13]. Todos estos antecedentes, nos llevaron a preguntarnos si los cambios que Cocaína produce en la mielinización estarían relacionados con la vía canónica de Wnt y si, además, forman parte de la historia previa de los individuos que dan lugar a la vulnerabilidad. Para empezar a contestar estas preguntas, decidimos utilizar un tratamiento sistémico con LiCl como una estrategia farmacológica que nos permita estudiar si los cambios en mielina inducidos por Cocaína estaban mediados por la vía canónica de Wnt. Para ello, administramos LiCl durante 7 de los 14 días de abstinencia a Cocaína para luego, por un lado, estudiar si revertía la expresión de sensibilización conductual e impedía los cambios moleculares previamente observados en la vía canónica de Wnt, y simultáneamente evaluar la expresión de Proteína Básica de Mielina (MBP). Los resultados de la presente tesis mostraron que el impacto de la administración de LiCl durante la abstinencia sobre la respuesta a Cocaína depende de los cambios que previamente produce el tratamiento con Cocaína en los animales, es decir si ocurre o no el desarrollo de sensibilización. Más aún, observamos que aquellos animales que no desarrollan sensibilización al recibir LiCl exacerban la expresión de la sensibilización; algo que no vimos en los animales tratados con Salina. Mientras que, en la expresión de β-catenina observamos resultados diferenciales de acuerdo al área estudiada y al impacto de Cocaína (tanto en el desarrollo como en la expresión). Por su parte, los niveles de MBP en NAcc presentaron una tendencia a estar aumentados en aquellos animales que recibieron el challenge con Salina y LiCl en la abstinencia con respecto a los que recibieron Salina durante la abstinencia. Este resultado también lo pudimos observar en CPF. Brevemente, en el NAcc la β-catenina se encuentra aumentada en los grupos que recibieron LiCl y que mostraron expresión de la sensibilización con respecto al grupo control. En tanto que, en CPF, son los niveles de β-catenina los que presentan mayores modificaciones. Así, en el grupo que recibe Salina se observan diferencias entre los animales que desarrollan y expresan sensibilización con respecto a aquellos que no lo hacen. En la expresión de MBP en CPF, se puede observar una disminución en el grupo que recibió LiCl y Cocaína, comparado con aquel que recibió Salina y Cocaína. En resumen, las variaciones de MBP y β-catenina podrían estar relacionadas con la vulnerabilidad a Cocaína. Más estudios son necesarios para confirmar esta conclusión. Por último, basados en evidencias previas del laboratorio (Cuesta et al 2017; 2020 [9][5]) así como en los resultados obtenidos en esta tesis sobre el impacto del estrés en la vía canónica de Wnt en CPF de machos, decidimos evaluar si los cambios en la vía de Wnt son suficientes para desarrollar sensibilización a Cocaína. Para ello se realizaron infusiones intra-cerebrales de Sulindac (inhibidor farmacológico de la vía canónica de Wnt [14]) en CPF por 5 días, y luego se aplicó una inyección de cocaína. Los resultados mostraron que la respuesta comportamental a Cocaína es superior en los animales que recibieron Sulindac de los que recibieron Vehículo; resultado que indicaría que la inhibición de la vía Wnt/β-catenina en CPF fue suficiente para inducir sensibilización a cocaína. En resumen, los hallazgos de este trabajo de tesis aportarían evidencias para comenzar a comprender la relación de la vía canónica de Wnt con las neuroadaptaciones y los diferentes mecanismos que median la respuesta a Cocaína. Principalmente, nos permitió comprender la importancia de la vulnerablidad individual como un factor determinante en nuestros resultados, sugiriendo un rol fundamental de las modificaciones de la vía canónica de Wnt en la CPF.
Regulación de la expresión y actividad de glicoproteína-p en hígado por prolactina
(2022) Ceré, Lucila Inés; Catania, Viviana A.; Ruiz, María Laura
El hígado desempeña un papel clave en la biotransformación y eliminación de compuestos endógenos y exógenos a través de la bilis. Los miembros de la superfamilia de transportadores ABC (ATP binding cassette) desempeñan un papel fundamental en la eliminación de compuestos tóxicos del organismo. Glicoproteína-P (P-gp) pertenece a los transportadores de eflujo ABC y se localiza en la membrana apical de los epitelios polarizados. En el hígado, P-gp desempeña un papel citoprotector crucial debido a su capacidad para transportar xenobióticos desde los hepatocitos a la bilis. La prolactina (PRL) es una hormona que regula múltiples funciones fisiológicas en mamíferos y sus niveles plasmáticos aumentan significativamente en diferentes situaciones fisiológicas, patológicas o farmacológicas. El receptor de PRL se expresa en hígado, entre otros tejidos, y se ha demostrado un papel directo de la hormona en la regulación de la función hepática. El objetivo de esta tesis fue evaluar la expresión y función de P-gp hepática en un modelo fisiológico de hiperprolactinemia y el mecanismo molecular subyacente, con el fin de dilucidar si la capacidad del hígado para eliminar xenobióticos a través de la bilis se ve alterada por PRL. En la membrana canalicular del hígado de rata, los niveles de proteína P-gp aumentaron significativamente en las ratas lactantes posparto a mediados (PP15) y finales (PP21) del periodo de lactancia. No se observaron cambios en la expresión de ARNm de Mdr1a en ninguno de los dos grupos. Por el contrario, los niveles de ARNm de Mdr1b aumentaron significativamente en el grupo PP15, sin cambios en el grupo PP21. La actividad hepática de P-gp medida con rodamina 123 (R123), un conocido sustrato de P-gp, también aumentó en ratas PP15. En el grupo PP21 no se observaron cambios en la actividad de este transportador. La infusión subcutánea de PRL (300 μg/día, 7 días), aumentó los niveles hepáticos de proteína P-gp y la actividad de transporte en ratas ovariectomizadas (OVX). La evaluación de la expresión génica mostró un aumento significativo de los niveles de Mdr1a luego del tratamiento con PRL. Los experimentos in vitro demostraron una regulación transcripcional de la inducción de P-gp por PRL. Los niveles de ARNm de Mdr1a y Mdr1b aumentaron significativamente en cultivos primarios de hepatocitos expuestos a PRL (0,1 μg/ml de PRL, 12 h). Este aumento fue prevenido por Actinomicina D, un inhibidor de la ARN polimerasa II. Un aumento de la expresión y actividad de P-gp en un estado fisiológico hiperprolactinémico como la lactancia, podría tener implicancia en la disposición de sus sustratos, afectando su biodisponibilidad y reduciendo sus efectos como agentes terapéuticos. Además, la regulación al alza de la P-gp podría tener un efecto citoprotector frente a compuestos tóxicos.

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