Desarrollo de un proceso de fermentación para la producción de EGasa1, una enzima capaz de mejorar la calidad del biodiesel

El biodiesel producido por transesterificación de aceites vegetales tiene un importante problema de calidad debido a la presencia de precipitados insolubles, compuestos en su mayoría por esteril glucósidos (EG). Recientemente nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un método enzimático para la eliminación eficiente de los EG del biodiesel, basado en la actividad de una β-glucosidasa de la bacteria Thermococcus litoralis. A partir de estos resultados, el presente trabajo, se basa en la optimización de un sistema de expresión en E. coli de la enzima EGasa1, enzima que hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. Se describe el correspondiente proceso de fermentación a alta densidad celular, de un método de recuperación de la enzima EGasa1 y finalmente el tratamiento enzimático de biodiesel. La enzima hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. En el primer capítulo se describe la ingenieria de E. coli para obtener una elevada producion específica de la enzima EGasa1. Inicialmente se optimizó el uso de codones del gen sintético egasa1 mediante el software Optimizer y se evaluó la expresión de dicho gen a partir de una biblioteca de promotores con distinta actividad. Los resutados obtenidos permitieron seleccionar al promotor pBAD, a partir del cual se evidenció un aumento del 40% de la actividad obtenida con respeto a la actividad inicial generada desde el promotor T7, a expensas de un inductor económico como la L-arabinosa. Dado que, gran parte de la proteína permanecía en la fracción insoluble, se evaluaron diferentes combinaciones de chaperonas moleculares con la finalidad de mejorar el plegamiento. Entre ellos se seleccionó el sistema GroES-GroEL, el cual permitió incrementar tres veces la actividad final de la enzima en la fracción soluble obtenida en cultivos en lote. El paso siguiente fue optimizar las condiciones de crecimiento. Con este fin se analizaron variaciones en la temperatura y DO600 de inducción y en la concentración de L-Arabinosa. Así, se determinó que los mejores niveles de actividad se obtuvieron cuando la cepa con los plásmidos pGro7 y pKCN-BAD-EGasa1 se indujeron en la fase exponencial de crecimiento con 0,5 g/L de L-arabinosa, a 37ºC. El Capítulo 2 tiene como punto de partida a una cepa capaz de expresar de manera soluble y eficiente la EGasa1, pero con una productividad específica (mg de EGasa1/g PS células) que aún puede ser mejorada. Con lo cual el paso siguiente fue el desarrollo del crecimiento en lote alimentado, el cual permite obtener cultivos de altas densidades celulares (HCDC, high cell density culture). Este proceso permitió incrementar el título del producto (U de EGasa1/ml) y la productividad específica (mg de EGasa1/g PS). Inicialmente se ensayó la construcción de operones que incluyan los genes que codifican para EGasa1, el sistema de chaperonas seleccionado previamente, GroES/EL, junto a genes accesorios (un transportador de glicerol (GlpF) y una enzima clave para la biosíntesis de ácidos nucleídos y aminoácidos (PrsA). La incorporación de estos genes accesorios no contribuyó significativamente a aumentar la actividad EGasa1/ml de cultivo en los ensayos realizados con respecto a la cepa que expresa a las chaperonas desde otro plásmido. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la mejor cepa para la producción de EGasa1 a gran escala es la variante que expresa la proteína EGasa1 a partir del plásmido pKCN-BAD-EGasa1, y el sistema de chaperonas GroES-GroEL a partir del plásmido pGro7, los cuales poseen orígenes de replicación compatibles e inducibles por agregado de L-arabinosa. El siguiente objetivo fue seleccionar la fuente de carbono que optimice el rendimiento de los lotes alimentados y disminuya los costos de producción. Los sustratos seleccionados fueron: glucosa, la fuente de carbono preferida para las fermentaciones industriales de E. coli, sacarosa, una materia prima económica proveniente de la caña de azúcar y glicerol, el subproducto más importante de la industria del biodiesel. Para poder utilizar la sacarosa como fuente de carbono, previamente se incorporó el operón metabólico cscAKB a la cepa E. coli BL21 AI. Se obtuvo así la cepa NK5 que crece eficientemente a expensas de sacarosa. Si bien los resultados de las diferentes fermentaciones muestran mayores rendimientos al utilizar glucosa; si se analiza la relación costo/rendimiento, resulta conveniente el uso de glicerol como fuente de carbono para obtener el menor costo de manufactura. El paso siguiente fue modificar el medio salino HM, con la finalidad de obtener un medio más simple y reducir los costos de producción. Para ello se eliminó el extracto de levadura y se reformuló el medio con el fin de minimizar la cantidad de componentes responsables de aportar fosfato, potasio, sodio y nitrógeno, resultando como formulación final: KH2PO4 y NaOH (27,8g/L y 1,32g/L respectivamente). El nitrógeno es aportado por el NH4OH utilizado para mantener en pH 7 el medio a lo largo del proceso de fermentación. En la siguiente etapa del proyecto se buscó determinar las condiciones de post-inducción que permitan obtener la máxima productividad volumétrica (U de EGasa1/ml/h). En primer lugar se analizaron perfiles de post-inducción típicamente utilizados en procesos industriales de producción de enzimas recombinantes: flujo constante 8 g/L/h y 12 g/L/h, flujo lineal (inicial 10 g/L/h, pendiente 0,7 g/L/h2), y un flujo proporcional a la densidad óptica (10 g/L/h para DO=100). Se determinó que el flujo de alimentación más adecuado para producir la enzima EGasa1 a partir de un lote alimentado de E. coli BL21 AI es el constante de 12 g/L/h. Utilizando este flujo se obtiene la mayor productividad (13,7 U/ml/h) luego de 6 horas de inducción a 37ºC. Finalmente se determinó que la relación molar carbono-nitrógeno (C:N) óptima en la solución de alimentación es 5. Con la misma se obtuvo el mayor valor de actividad EGasa1, 466 U/ml. Todos los resultados obtenidos sugieren que las condiciones de fermentación: medio de cultivo, fuente de carbono, método de alimentación post-inducción y relación carbono nitrógeno post inducción son factores importantes que afectan la producción de EGasa1 de E. coli. En en el último capítulo de este trabajo se escaló exitosamente la fermentación a 1000L. También se diseñó el procesamiento de los cultivos y posterior purificación de EGasa1. Para esto se tuvieron en cuenta las características de la enzima: proteína termofílica y asociada a membrana. De esta manera se establecieron las condiciones óptimas de lisis: calentamiento a 80ºC durante 20 minutos, con el agregado de 1% de alcohol láurico etoxilado (7 moles). Finalmente, se determinaron las condiciones de hidrólisis enzimática de EG en biodiesel. Los datos obtenidos permitieron determinar que la temperatura y pH óptimos de hidrólisis fueron 6,75 y 65ºC respectivamente. Se redujo la cantidad de enzima necesaria a 7μg por gramo de biodiesel para la eliminación completa de los EG, y la cantidad de agua utilizada en la hidrólisis al 4,5% del volumen de biodiesel tratado, lo que disminuyó la cantidad de agua residual que se genera. Además, la concentración de iones presentes en el buffer de hidrólisis se redujo, disminuyendo la concentración del buffer fosfato a 10 mM y la del NaCl a 20 mM. El proceso de tratamiento se escaló exitosamente hasta 20 toneladas usando un reactor agitado, en el cual 7g de EGasa1 por tonelada de biodiesel eliminaron por completo las 75 ppm de EG presentes en la muestra en aproximadamente 2 h. Las pruebas de calidad internacionales TC, CSFT, FBT y CSFBT realizadas con el biodiesel tratado con EGasa1 indicaron que la calidad de este biodiesel es comparable a la del biodiesel destilado.