Interacción de las proteínas de procesamiento con los precursores de miARN y su mecanismo en plantas

DCL1 es la enzima ribonucleasa central en la biogénesis de micro-ARNs en plantas. Su función consiste en realizar dos cortes sucesivos sobre transcriptos primarios para liberar el micro-ARN maduro. El mecanismo a través del cual la enzima reconoce los sitios de corte sobre los precursores resta ser elucidado. La enzima presenta dos dominios de unión a ARN doble hebra en tándem en el extremo carboxilo-terminal, los cuales son esenciales para su funcionamiento in vivo. En este trabajo de tesis nos dedicamos principalmente a la descripción biofísica del primero de los dominios de unión a ARN doble hebra de DCL1 de Arabidopsis thaliana, el cual se encuentra altamente conservado entre las distintas especies de plantas. Demostramos que el dominio libre en solución de encuentra desestructurado tanto en forma aislada como en presencia de regiones vecinas de la proteína. A pesar de estar desestructurado, es capaz de unir ARN sustrato. Mediante el análisis estructural del complejo con el ARN encontramos que el dominio adquiere una conformación plegada al entrar en contacto con el sustrato. La topología de la conformación plegada adquirida, que calculamos en base a datos de RMN, se corresponde con la esperada para un dominio de la familia de los dominios de unión a ARN doble hebra. Una vez definidas las características de este sistema procedimos a realizar, por un lado, una descripción más profunda de la forma libre desestructurada y, por otro, proponer un mecanismo posible para la unión al sustrato y plegamiento de la proteína. De la forma libre podemos decir que globalmente es una especie flexible, aunque no se encuentra completamente desestructurada. A través de distintos observables de RMN logramos determinar que la región correspondiente al extremo carboxilo-terminal presenta una cierta rigidez y explora conformaciones tipo hélice alfa. La presencia de esta estructura preformada podría resultar esencial para la unión al sustrato y el plegamiento. En cuanto al mecanismo de unión y plegamiento pudimos obtener evidencia que sugiere la existencia de un complejo intermediario entre la forma libre desplegada y la forma plegada unida al ARN. En este complejo intermediario la proteína se encuentra en una tercer especie, también mayormente desplegada y unida al sustrato. Finalmente en una tercera etapa del trabajo nos abocamos al estudio desde el punto de vista estructural de precursores completos de micro-ARNs. Buscamos validar los determinantes que permiten reconocer la posición del micro-ARN dentro del precursor por parte del complejo de procesamiento formado por DCL1 y las proteínas accesorias HYL1 y SERRATE. Estudiamos cuatro precursores de diferentes familias por técnicas bioquímicas de sondeo de estructura secundaria y flexibilidad de la cadena. Logramos validar experimentalmente determinantes estructurales propuestos a partir de estructuras calculadas in silico. También encontramos indicios que sugieren que la posición del sitio del primer corte, el cual es fundamental para definir el registro de los cortes sucesivos ejecutados por DCL1, podría estar relacionada con un cambio abrupto desde una región de la hebra con una conformación flexible a una de menor flexibilidad. Esta particularidad podría estar permitiendo una interacción específica con las proteínas que conforman el complejo de procesamiento.