Biosíntesis de ácido lipoico y proteínas lipoiladas en tripanosomátidos

El tratamiento de las infecciones por tripanosomas depende de un pequeño número de drogas que tienen limitada eficacia y pueden causar severos efectos secundarios. El ácido lipoico (AL) es una molécula esencial para la viabilidad de la mayoría de los organismos procariotas y eucariotas de metabolismo aeróbico. No sólo por su participación como cofactor de complejos multienzimáticos que intervienen en la respiración celular y el metabolismo central sino también por su papel como regulador redox. Es por ello que se plantearon como objetivos principales de esta tesis: i) validar el metabolismo de lipoilación de proteínas en Trypanosoma cruzi como potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico, y ii) identificar y caracterizar las enzimas involucradas en dicho metabolismo. Dado que existen antecedentes en la utilización de análogos estructurales de AL como inhibidores del crecimiento de distintos microorganismos, incluyendo parásitos como Plasmodium falciparum, se decidió ensayar el efecto del inhibidor más conocido, 8-bromo-octanoato (BrO), sobre cultivos de T. cruzi epimastigotes de las cepas CL Brener y Dm28c. Se realizaron curvas de inhibición a distintas concentraciones que evidenciaron un efecto letal sobre los parásitos. No obstante, las concentraciones requeridas fueron altas como para ser relevantes en términos quimioterapéuticos (EC50 = 0,591 ± 0,190 mM para CL Brener y EC50 = 0,829 ± 0,033 mM para Dm28c). Tras demostrar que por la falta de transportadores específicos el BrO no era incorporado eficientemente por los parásitos, se sintetizó un derivado metil éster –metil-8-bromo-octanoato (MBrO)- presumiblemente más permeable a la membrana celular y se ensayaron nuevas curvas de inhibición mejorándose la efectividad de la droga en hasta un orden de magnitud (EC50 = 66,18 ± 10,40 μM y 62,17 ± 7,46 μM para una y otra cepa). Por otro lado, se estudió si este efecto letal en el crecimiento se debía efectivamente a la inhibición del metabolismo de lipoilación. Mediante la realización de western blots anti-lipoamida se pudo apreciar cómo el tratamiento con ambas drogas disminuía o suprimía por completo la lipoilación de proteínas. Más aún, observamos que la señal de una de las proteínas lipoiladas, la subunidad E2 (E2p) del complejo piruvato deshidrogenasa (PDH), mostraba una intensidad muy baja respecto del resto, razón por la cual nos preguntamos –teniendo en cuenta las funciones metabólicas de cada complejo lipoilado- si las condiciones de cultivo estarían influyendo. Efectivamente, al crecer cultivos en condiciones de baja glucosa (de una concentración diez veces menor a la utilizada en el medio LIT convencional) y realizar extractos mitocondriales y nuevos western blots, la señal de E2p aumentó notoriamente. Por último, demostramos que las actividades α-oxoácido deshidrogenasas de los complejos lipoilados desaparecían en extractos de cultivos tratados con MBrO. Adicionalmente, vimos que la actividad PDH aumentó hasta cinco veces en condiciones de baja glucosa. En su conjunto, estos resultados nos permitieron validar el metabolismo de lipoilación de proteínas de T. cruzi como un potencial blanco quimioterapéutico, que además sería de efecto altamente pleiotrópico. En segundo lugar, tras observar que BrO (análogo de AL) y octanoato libre (precursor de AL) son incorporados pobremente al interior celular, aportamos nuevas evidencias a favor de la ausencia de la vía de salvataje de AL en tripanosomátidos, en concordancia con otras evidencias reportadas en T. brucei por otros laboratorios. Estos resultados plantearon la necesidad de profundizar nuestro conocimiento sobre los mecanismos involucrados en el metabolismo de lipoilación del parásito, los cuales deben ser lo suficientemente divergentes en términos evolutivos de aquellos presentes en el ser humano para poder diseñar fármacos inocuos para nuestra salud. Por ello se identificaron las enzimas que participan en la síntesis de novo de AL y se caracterizaron dos de ellas. En este caso, se trabajó con los genes de Trypanosoma brucei dado que el genoma de T. cruzi fue realizado sobre la cepa CL Brener, un híbrido de poliploidía incierta y especie que se caracteriza por poseer múltiples alelos. En primer lugar, mediante ensayos de reversión de fenotipo de levaduras mutantes lip2, incapaces de sintetizar AL por falta de una octanoiltransferasa, se demostró que el gen Tb927.11.9390 (TblipT) codifica una octanoiltransferasa específica para la proteína H y la subunidad E2p. Se ensayaron distintos medios de cultivo: YPG, YNBDGly, YPS e YPE (suplementado con AL u octanoato 50 μM, y sin suplementar), ajustándose a nuestra hipótesis el comportamiento de las cepas complementadas con el gen de interés, en todos los casos y según el medio en cuestión. Estos resultados fueron revalidados mediante western blots anti-lipoamida, tanto en extractos de proteínas de levaduras mutantes como de Escherichia coli doble mutantes (cepa TM136), ambas expresando el gen de T. brucei. Cabe destacar que este último caso nos permitió dilucidar por completo la especificidad de TbLipT, dado que en las levaduras mutantes lip2, la actividad de una de las enzimas funcionales endógenas de la vía de síntesis de AL, Lip3, enmascaraba los efectos de nuestra enzima en estudio, no así en el caso de TM136, donde pudimos determinar la capacidad de esta enzima de acilar la subunidad E2p. Se realizó un estudio análogo al de TblipT con el gen Tb927.8.630 (TblipL), de particular importancia debido a que como hemos indicado, los tripanosomas carecen de la vía de salvataje de AL. Curiosamente, TblipL posee homología con lipoato proteína ligasas, enzimas que intervienen en dicha vía. No obstante, estas enzimas pertenecen a una superfamilia caracterizada por conservar cierto grado de homología secuencial y estructural pero de funciones diversas, incluyendo octanoiltransferasas, amidotransferasas, octanoil-CoA:proteína transferasas e incluso biotina proteína ligasas. Se realizaron ensayos de reversión de fenotipo de la mutante de levadura lip3, carente de una enzima con aparente actividad amidotransferasa u octanoil-CoA:proteína transferasa. La complementación funcional provocada por TbLipL en los medios YNBDGly e YPE (suplementado y sin suplementar) indicaría que se trata también de una acil transferasa, pero específica para E2k, subunidad del complejo α-cetoglutarato deshidrogenasa (KGDH). Ensayos de western blots anti-lipoamida realizados a partir de extractos mitocondriales de levaduras mutantes lip3 complementadas con TblipL mostraron la aparición de una banda correspondiente a E2k, revalidando los resultados y conclusiones. Proponemos que los tripanosomas carecen de una vía de salvataje de AL libre y lipoilan sus proteínas mediante la síntesis de novo. En esta vía, una octanoiltransferasa LipT transfiere residuos octanoilos desde octanoil-ACP a la proteína H del complejo de clivaje de glicina y a la subunidad E2 de PDH. Una ligasa/amidotransferasa (LipL) octanoila las subunidades E2 de KGDH y presumiblemente -dado que no está presente en levaduras- del complejo deshidrogenasa de α-cetoácido de cadena ramificada, a partir de un dador de octanoilos aún no caracterizado. Una tercera enzima identificada bioinformáticamente, LipS, de actividad lipoato sintasa y altamente conservada, catalizaría la inserción de dos átomos de azufre sobre los grupos octanoilos, ya incorporados a H, E2k y E2p, convirtiéndolas en las holoproteínas lipoiladas. La vía descripta, además, ha sido validada como un potencial blanco quimioterapéutico de efecto altamente pleiotrópico.