Aplicación de reacciones en paralelo para la obtención de extractos modificados

El acceso a bibliotecas de compuestos con propiedades biomoleculares interesantes es una etapa limitante en el proceso de descubrimiento de drogas. Los productos naturales (PNs) han sido muy valiosos como plataformas validadas biológicamente por contener esqueletos moleculares que presentan dichas cualidades. En una serie de artículos de revisión, Newman, Craig y colegas, han analizado las fuentes de drogas demostrando la valiosa y continua contribución de las plataformas naturales como fuente de compuestos líderes que han servido de inspiración para la síntesis de nuevas drogas. De los nuevos medicamentos aprobados por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (FDA, del inglés Food and Drug Administration) entre 1981-2010, el 34 % estaban basados en moléculas pequeñas de PNs o derivados directos de los mismos, incluyendo las estatinas, diferentes medicamentos contra el cáncer y algunos inmunosupresores. La preparación de extractos modificados (EMs) a través de diversificación química dirigida representa una forma alternativa e interesante de usar esqueletos naturales conocidos y desconocidos como material de partida para la generación de bibliotecas semisintéticas de compuestos con propiedades biológicas de interés. La clave para lograr la alteración de una proporción significativa de los componentes de una mezcla compleja yace en la selección de potenciales grupos reactivos que puedan ser encontrados en la mayoría de las pequeñas moléculas presentes en PNs e introducir nuevas funcionalidades potencialmente activas en propiedades de reconocimiento molecular. La hipótesis postulada en mi trabajo de tesis plantea la utilización de secuencias de reacciones dirigidas a transformar grupos funcionales de alta presencia en compuestos de plantas medicinales lo cual permitiría incorporar nuevos fragmentos relevantes como farmacóforos y diversificar las propiedades biomoleculares de sus componentes. Las modificaciones químicas en PNs están dirigidas al desarrollo de funcionalidades atípicamente encontradas en derivados de origen natural a través de reacciones destinadas a transformar grupos funcionales (GF) de alta presencia en PNs tales como dobles enlaces, anillos aromáticos, carbonilos, aminas y alcoholes. La incorporación de átomos de halógeno es una estrategia común para modificar moléculas con el objeto de alterar sus bioactividades y especificidades. Diferentes estudios demuestran que la proporción de halógenos en drogas es significativamente mayor que en productos naturales. Dentro de los metabolitos secundarios halogenados, aquellos que contienen bromo se encuentran en el segundo lugar en abundancia, luego de los clorados. Estos metabolitos son mayoritariamente producidos por organismos marinos (algas, esponjas, corales, moluscos, etc.), a partir de los cuales se han aislado varios metabolitos con actividad antibacteriana, antitumoral, antiviral y antifúngica. En contraste, las plantas terrestres raramente contienen compuestos bromados por lo que consideramos interesante realizar la bromación de esqueletos naturales presentes en extractos de plantas no marinas y analizar el efecto de este proceso sobre las propiedades biomoleculares de las mezclas. El contenido de azufre de los productos naturales extraídos de plantas es inferior al contenido observado en otras de fuentes de origen natural. De los 6.629 compuestos de origen vegetal reportados en la Base de Datos de Productos Naturales Bioactivos (BDPNB), sólo un 2,1 % incorporan azufre en sus estructuras. Los GF azufrados presentes en productos naturales son variados. Entre ellos se encuentran tioles, sulfuros, disulfuros, tiosulfonatos, tiosulfinatos, sulfóxidos, sulfonas, isotiocianatos, polisulfuros, ácidos sulfínicos y sulfénicos. La baja cantidad de compuestos azufrados encontrados en plantas, la relativamente baja diversidad de GF encontrados dentro de ellos y las importantes actividades biológicas que muestran, hacen interesante la introducción de este elemento en productos naturales de origen vegetal. Si bien los grupos nitrogenados se encuentran presentes en una buena cantidad de productos naturales, su abundancia es inferior a la observada en poblaciones de moléculas empleadas como drogas. Dentro de los grupos nitrogenados presentes en productos naturales, aquellos que contienen dos átomos de nitrógeno adyacentes representan una porción minoritaria. Específicamente, las moléculas que contienen hidracinas, hidrazidas o hidrazonas sólo representan, de acuerdo a un análisis estadístico, el 0,7% del total de metabolitos secundarios. Todo esto convierte al grupo N-N en un fragmento interesante a ser introducido en esqueletos de productos naturales. La modificación de grupos C=O, presentes en más del 70% de los PNs, ofrece el acceso óptimo para la incorporación de N a través del empleo de hidracina. La alta diversidad química de las moléculas presentes en extractos de PNs vegetales y el hecho de desconocer las composiciones químicas de estas mezclas sumado al cambio estructural que se produce al modificarlas, hace que el análisis de los extractos de partida y modificados resulte un desafío. Por este motivo, tanto el seguimiento de las reacciones como el monitoreo de su efecto sobre las propiedades de las mezclas se efectúa por comparación de sus (1) perfiles químicos y (2) perfiles de bioactividad. 1) Los perfiles químicos tienen como objeto intentar estimar el éxito de la reacción y su impacto en la composición. Con “éxito de la reacción” nos referimos a observar cambios en propiedades relacionadas a los GF de alta presencia o a GF que se desean introducir en la mezcla. Con “impacto en la composición” nos referimos al grado en que la composición química es alterada por la reacción. Dentro de las técnicas analíticas útiles para establecer perfiles y analizar la composición de mezclas complejas como son los extractos vegetales, pueden considerarse a las cromatográficas, espectrométricas y a sus combinaciones como las más relevantes. Dentro de las técnicas cromatográficas, la cromatografía líquida asociada a espectrometría de masa (CL-EM) es una técnica muy usada para el análisis de mezclas complejas de origen natural que se ha impuesto como una combinación robusta que permite la identificación de cientos de metabolitos en mezcla. El acoplamiento de técnicas de separación cromatográfica como CL a analizadores de masa permite una correcta deconvolución de los picos de mezclas complejas debido a la alta velocidad de escaneo que presentan estos instrumentos. El impacto en la composición de los extractos fue estudiado utilizando CL-EM además de cromatografía en capa delgada (CCD) aplicando diferentes reveladores, entre ellos 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH). 2) La comparación de perfiles de bioactividad entre extractos de partida y EMs se realizó a través de ensayos autográficos. Dado que los métodos autográficos combinan la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada con la determinación in situ de la actividad biológica de los componentes de una mezcla, en conjunto permiten pre-asignar de manera cualitativa bioactividad sobre uno o más componentes de la misma. Se utilizaron ensayos autográficos previamente desarrollados y descriptos por nuestro grupo para detectar inhibidores de acetilcolinesterasa, xantina oxidasa, β-glucosidasa y tirosinasa. Además, con el objeto de analizar el efecto de la modificación química frente a nuevas propiedades biomoleculares, se aplicó el ensayo que permite detectar inhibidores del Bromodominio Funcional 3 de Trypanosoma cruzi (TcBDF3), el cual juega un papel muy importante como potencial blanco terapéutico contra la enfermedad de Chagas. Este último estudio se hizo en colaboración con el grupo del Dr. Esteban Serra. En principio se prepararon extractos provenientes de plantas medicinales (Cynara scolymus, Peumus boldus, Arctium lappa y Silybum marianum) utilizando dos metodologías: extracción por calentamiento a reflujo y maceración. Los dos tipos de extracciones se realizaron con el fin de observar si se producía alguna diferencia en la composición química de los extractos obtenidos a partir de la aplicación de cada una de las mencionadas técnicas extractivas. En particular, sobre el material utilizado de la especie S. marianum se aplicó previamente extracción por Soxhlet utilizando hexano como solvente, debido a que la droga vegetal posee un alto contenido de grasas. Una vez preparados todos los extractos, se analizaron cualitativamente sus composiciones químicas. Para ello, se utilizaron CCD y CL-EM. Los extractos de C. scolymus y S. marianum obtenidos por maceración y por reflujo mostraron perfiles cromatográficos diferentes, por lo cual todos los extractos provenientes de estas dos especies fueron seleccionados para modificación química. En cambio, los de A. lappa y P. boldus obtenidos por maceración y calentamiento a reflujo mostraron perfiles cromatográficos muy similares y por ello sólo los extractos macerados fueron seleccionados para su posterior modificación química. En paralelo, se modificaron 7 extractos nativos (de C. scolymus obtenidos por maceración y calentamiento a reflujo; de S. marianum obtenidos por Sohxlet, maceración y calentamiento a reflujo; de P. boldus y A. lappa obtenidos por maceración), aplicando reacciones de bromación, sulfonilación o hidracinólisis, utilizando como reactivos bromo, cloruro de p-toluen sulfonilo o hidracina monohidrato (N2H4.H2O), respectivamente. Se obtuvieron en total 42 extractos modificados a partir de los 7 extractos de partida. El éxito de las reacciones de modificación se estudió utilizando CCD y CL-EM, a través de cambios detectados en extractos modificados vs. extractos de partida. El impacto de la modificación química sobre la composición de los extractos fue evaluado inicialmente por CCD utilizando diversos reveladores. Interesantemente, tras la reacción de hidracinólisis, se observó la presencia de nuevos compuestos captadores de radicales DPPH en el cromatograma de los extractos modificados de A. lappa, P. boldus, C. scolymus y S. marianum. Este resultado nos llevó a sugerir que la reacción de modificación con hidracina daba lugar a la formación de nuevos compuestos los cuales podrían contener en su estructura porciones provenientes de N2H4.H2O. Por otro lado, el efecto de la modificación química de los extractos sobre las propiedades biomoleculares fue evaluado por medio de cuatro ensayos bioautográficos que permiten detectar inhibidores de las enzimas β-glucosidasa, acetilcolinesterasa, xantina oxidasa y tirosinasa. La falta de actividad inhibitoria de todas las mezclas (naturales y semisintéticas) frente a las tres primeras enzimas nos permitió concluir que para este grupo de extractos sus propiedades biomoleculares no cambian tras las reacciones aplicadas o bien los cambios no son detectables bajo las condiciones experimentales empleadas. Sin embargo, los resultados frente a tirosinasa mostraron cambios de bioactividad en los extractos de C. scolymus modificados con N2H4.H2O, no resultando así para el conjunto los demás extractos. La comparación de perfiles de CL-EM de los extractos de C. scolymus, de partida y modificados con N2H4.H2O, permitió visualizar cambios significativos en la composición. Uno de los cambios definidos fue la desaparición del pico correspondiente a un compuesto en particular, ácido clorogénico, presente en el extracto de partida y ausente en el extracto modificado de C. scolymus. Dada la actividad frente a tirosinasa hallada en los extractos de esta especie modificados con N2H4.H2O, planteamos como probabilidad que la misma podría surgir de la generación de compuestos provenientes de la modificación del ácido clorogénico (mono-cafeoilquínico) con N2H4.H2O. Este metabolito se encuentra descripto en la droga vegetal de la especie y puro resultó inactivo frente a tirosinasa al igual que los extractos de partida de C. scolymus. La purificación por cromatografía en columna (CC) del extracto modificado y el posterior análisis de los espectros de RMN y EM de las fracciones purificadas activas, permitieron detectar la presencia de una tentativa pirazolidinona producto de la reacción entre el ácido clorogénico e N2H4.H2O. Se modificó químicamente ácido clorogénico puro con N2H4.H2O siguiendo las mismas condiciones de reacción aplicadas en los extractos, las cuales fueron luego optimizadas. La optimización muestra que la cantidad de N2H4.H2O utilizada durante la reacción de modificación es clave para la generación de los productos modificados que resultan activos frente a tirosinasa. Paralelamente, se modificó cafeoato de metilo (contiene la porción cafeoil presente en el ácido clorogénico) con N2H4.H2O y el producto obtenido mostró el mismo perfil de actividad tirosinasa que el encontrado para los productos del clorogénico modificado con N2H4.H2O. Con experimentos de CLAE-EM se detectaron masas coincidentes con las correspondientes a cafeoilpirazolidinona y cafeoilhidrazida potencialmente resultantes de la hidracinólisis del cafeoato de metilo. Se escaló la reacción de modificación de cafeoato de metilo con N2H4.H2O y se obtuvo una mezcla de compuestos activos que al intentar ser purificada y sus fracciones caracterizadas por RMN y CLAE-EM, nuevamente mostraron la posible pirazolidinona y la acilhidrazida anteriormente mencionadas en mezcla. Se planificaron y realizaron sucesivas purificaciones mediante CC en fase normal y también por CLAE preparativo en fase reversa con previa optimización del método por CLAE analítico. Aun así, no se lograron separar totalmente los compuestos propuestos. A partir de los resultados alcanzados se plantearon posibles mecanismos de reacción de la porción cafeoil del ácido clorogénico con N2H4.H2O que podrían dar lugar a los potenciales productos de reacción antes descriptos. Se modificaron además con N2H4.H2O otros componentes de C. scolymus como rutina y luteolina. No se detectó actividad frente a la enzima tirosinasa luego del lavado de la reacción y sin mayor grado de purificación. Se halló un compuesto ubicuo, el cual se genera a partir de la reacción entre acetato de etilo (AcOEt) e N2H4.H2O durante el lavado de la reacción, motivo por el cual se modificó el protocolo de la reacción de hidracinólisis obviando lavados con AcOEt. En relación a este compuesto ubicuo se caracterizó haciendo experimentos de RMN de 1H, 13C, 15N, EM y espectroscopía IR. Todo esto condujo a que dicho compuesto es la diacetil hidrazida. La misma resultó activa frente a la enzima tirosinasa y no tiene citotoxicidad reportada. Diacetil hidrazida presentó una concentración que inhibe el 50% de la actividad enzimática (CI50) en 7.59 ± 0.75 μM, siendo 1,56 veces más activo que el inhibidor de referencia ácido kójico (CI50 = 11.97 ± 0.75 μM). Se evaluó además su citotoxicidad empleando líneas celulares VERO encontrando que hasta 200 μM no es citotóxico. Este experimento fue realizado en colaboración con el grupo del Dr. Esteban Serra.Con el objeto de analizar el efecto de la modificación química de los extractos sobre otras propiedades biomoleculares se aplicó un nuevo ensayo que permite detectar inhibidores del bromodominio TcBDF3. En cuanto a este ensayo biológico se halló actividad sobre el extracto de S. marianum bromado. Una de las subfracciones obtenidas, luego de realizar purificación por CC, recupera la actividad del extracto total. Se trabajó luego, con los componentes mayoritarios reportados para dicho extracto, que son el grupo de las silimarinas y taxifolina. Ambos se modificaron con bromo, resultando activa una fracción de purificación proveniente del grupo de las silimarinas bromadas, con una actividad del orden de la del inhibidor de bromodominios iBET-151. El ensayo de inhibición con proporciones en que el grupo de las silimarinas y taxifolina se hallan en el extracto (20:1, respectivamente), utilizando silimarina y taxifolina modificadas con bromo, indicó que la mezcla (20:1) es activa, pero en menor proporción que iBET-151. Esto sugiere que el grupo de las silimarinas bromadas sería responsable de la actividad.