Variantes genéticas en secuencias formadoras de cuádruplex de guanina: consecuencias sobre la expresión de genes asociados a patologías humanas

Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. En particular, existe gran cantidad de evidencia sobre la regulación de genes asociados al desarrollo de patologías humanas mediada por G4, principalmente de proto-oncogenes. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de las variantes genéticas presentes en las secuencias con capacidad de formar G4 (sG4), y el efecto que las mismas generaban sobre los G4. Por este motivo decidimos investigar si las SNV (de las siglas del término en inglés single nucleotide variants) presentes en los G4 podrían contribuir a la expresión génica diferencial entre individuos que pueda conducir a la predisposición o al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esto se realizó una búsqueda y selección bioinformática de SNV en secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) localizadas en regiones reguladoras de la transcripción de genes asociados con patologías humanas. Realizamos una búsqueda bibliográfica orientada en dos ejes. El primero fue buscar SNV-sG4 asociadas a variaciones transcripcionales reportadas en la literatura, y el segundo eje se enfocó en la búsqueda de sG4 en regiones promotoras proximales y con funciones en la regulación de la transcripción de proto-oncogenes reportados en la bibliografía y la posterior identificación de SNV presentes en esas sG4. Los resultados de la búsqueda rindieron 14 genes con 88 SNV-sG4 presentes en ellos. Luego se analizaron las secuencias de las sG4 utilizando predictores bioinformáticos de G4 para comparar y seleccionar 43 SNV-sG4 de 14 genes que podrían generar mayores cambios en la capacidad de formación de G4. Para caracterizar el efecto de las SNV-sG4 seleccionados en la formación y/o estabilidad de los G4 realizamos diversas técnicas bioquímicas y espectroscópicas in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos. Esto nos permitió restringir la selección a 12 SNV-sG4 de 4 genes, que fueron los que evidenciaron cambios significativos en la formación y estabilidad del G4. Por último, evaluamos las consecuencias de las SNV-sG4 que afecten la formación y/o estabilidad de los G4 sobre la expresión génica transcripcional en el contexto celular. Para ello se clonaron las sG4 en un sistema de gen reportero, corriente arriba del promotor básico (SV40) que regula el gen que codifica a la luciferasa de luciérnaga en el plasmídico pGL3- Promoter Vector (pGL3-PV, Promega). Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular humana Human Embrionic Kidney o HEK-293 y se evaluaron los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Pudimos observar variaciones significativas en los niveles de actividad del reportero regulado por el promotor SV40 en presencia de las SNV en comparación con las sG4. También, utilizando la regulación transcripcional del proto-oncogen c-MYC mediada por G4 como modelo de estudio, se analizó el efecto de las SNV-sG4 en el contexto del promotor mediante el clonado de un fragmento 850 pb (pares de bases), (-337/+513 respecto del sitio de inicio de la transcripción o TSS) del promotor del gen, el cual contiene a la sG4, y la generación de las SNV-sG4 en estudio para esa sG4. Las construcciones fueron transfectadas en HEK293 evaluando los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Como resultado de la transfecciones pudimos observar variaciones significativas de la actividad del reportero para algunas de las SNV-sG4, respecto a la versión WT (wild type). Estas evidencias nos permitieron inferir que la presencia de ciertas variantes estaría influyendo en los niveles de expresión del gen reportero regulado por el promotor de c-MYC en las construcciones plasmídicas. Colectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis aportan nuevas evidencias sobre el efecto de las SNV presentes en las sG4 sobre la formación de G4, tanto de manera bioinformática como in vitro, y su influencia en la regulación de los niveles de transcripción en un contexto celular. Los resultados recogidos en este trabajo sugieren que las SNV-sG4 que alteran el plegamiento de G4 pueden ser la causa de la expresión diferencial de genes y podrían considerarse como un nuevo mecanismo de etiología molecular para la predisposición o el establecimiento de patologías humanas, como el cáncer en el caso de los oncogenes.