Estudios genéticos sobre las vías de producción de aroma en bacterias ácidos lácticas: El caso de Lactococcus lactis subspecies lactis biovariedad diacetylactis

Una de las prácticas más habituales para mejorar la calidad en alimentos lácteos es el uso de bacterias lácticas como cultivos iniciadores. Entre ellas, Lactococcus lactis es una de las mas utilizadas a causa de que puede generar compuestos de aroma C4 (acetoína, diacetilo o 2,3-butanodiol) y dióxido de carbono, modificando las características organolépticas de los alimentos fermentados. En L. lactis normalmente la mayoría del piruvato derivado de azúcares es convertido a lactato, mediante la fermentación homoláctica. Esta reacción es catalizada por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), la cual es activada por el intermediario glicolítico fructosa-1,6-bifosfato (FBF). De esta manera, los altos niveles de NADH que se producen durante la glicólisis son reoxidados logrando así el balance redox. Durante este crecimiento L. lactis se produce una reducción del pH del medio externo de varias unidades y como consecuencia se produce la inhibición de la glucolisis que detiene su crecimiento. En estas condiciones la acumulación de piruvato resulta tóxica para las células, una de las vías posible de detoxificación de este compuesto es la vía de producción de diacetilo y acetoina. En este trabajo de tesis se analizó la vía de diacetilo y acetoina en la cepa industrial L. lactis y su contribución a la homeostasis de pH. Para eso, obtuvimos una cepa de L. lactis mutante en el gen als, codificante para la síntesis de a acetolactato. Inicialmente se observo que la producción de compuestos C4 en la cepa parental L. lactis IL1403 a pH bajo incrementa la producción de compuestos C4 (acetoina / diacetilo). La Interrupción del gen als en la cepa ILGR1 (isogénica a la cepa IL1403) era incapaz de generar compuestos de aroma comparadas con las mismas condiciones que la cepa parental. Esta mutante derivada de la cepa IL1403 nos permitío estudiar el metabolismo de piruvato independiente del citrato. Realizamos experimentos que nos permitieron analizar el comportamiento de estas bacterias en medios suplementados con piruvato a diferentes valores de pH ácidos. Se compararon los crecimientos de las cepas IL1403 (salvaje) e ILGR1 (als mutante) en medio M17, con la adición de glucosa 10mM, piruvato 20 mM o con ambas fuentes de carbono. Los resultados obtenidos, no presentaron diferencias significativas entre ambas cepas en lo que respecta al crecimiento en M17 a pH inicial de 7. Del mismo modo, el efecto en el crecimiento al adicionar piruvato para ambas cepas evaluado a un pH inicial de 5.5, la curva de crecimiento de la cepa IL1403 fue similar a la correspondiente a la cepa ILGR1. Sin embargo, cuando el pH del medio fue disminuido a un valor de 4.5, pero no hubo crecimiento en la cepa mutante, indicando una toxicidad del piruvato para esta cepa. Ambas cepas crecieron en la presencia de glucosa y piruvato en el medio. A pH 5.5, menores niveles de biomasa se detectaron para la cepa ILGR1, con respecto a la salvaje, esta última mostrando un aumento en su crecimiento en relación al medio sólo suplementado con glucosa. Notablemente, cuando el medio fue llevado a un pH de 4.5 la incapacidad parcial de la cepa ILGR1 para crecer fue total en presencia de piruvato, aún en presencia de glucosa, mientras que la cepa IL1403 fue capaz de crecer. Estos experimentos demostraron el requerimiento del producto del gen als para el cometabolismo de piruvato y glucosa. Para determinar si el crecimiento observado de la cepa mutante está relacionado con su incapacidad de contrarrestar la acidificación decidimos evaluar cambios en el pH externo en los cultivos en batch. El metabolismo de glucosa provocó una acidificación máxima del pH externo a valores cercanos a las 4.5-4.7 unidades, para ambas cepas. Cuando sólo piruvato fue adicionado como fuente de carbono, ninguna de las cepas mostró una acidificación significativa del medio de cultivo y el pH final se mantuvo cercano al inicial. Un comportamiento similar fue observado para la cepa salvaje en M17GP, con una acidificación externa que alcanza valores de 5.1 a las 4 horas y vuelve a 5.5 a las 8 horas. Por otro lado, luego de mostrar una acidificación inicial similar, la acidificación del pH externo por parte de la ILGR1 continuó cayendo hasta valores de 4.8 unidades luego de 8 horas, es decir, cayó 0.7 unidades de pH más que la cepa salvaje. De acuerdo con esto, la cepa mutante alcanzó una DO final mucho más baja que la salvaje. Para la cepa mutante también se detecta un cometabolismo más leve entre glucosa y piruvato, pero como el piruvato no se deriva a C4, produce ácidos orgánicos como el acetato y el pH baja, pero igualmente se llega a un pH mayor que con glucosa sola. Cuando el pH inicial fue de 4.5, la cepa IL140 mostró una acidificación de 0.3 unidades cuando creció en presencia de glucosa, mientras que incrementó 0.6 unidades cuando el piruvato fue adicionado al medio. In la presencia de ambos compuestos, un equilibrio entre ambas tendencias fue observado, llegando a un pH de 4.8. En contraste, aún cuando la cepa ILGR1 mostró un comportamiento de acidificación similar en la presencia de glucosa, no fue capaz de alcalinizar en medio cuando se adicionó piruvato, llevando a una incapacidad de la cepa de crecer. Por último, intentamos correlacionar estos descubrimientos con los cambios en el pH intracelular, monitoreando los niveles internos de H+ usando la sonda fluorescente sensible al pH BCECF. Cuando las dos cepas fueron cargadas con la sonda fluorescente observamos que la cepa IL1403 fue sujeta a un pulso de piruvato 50 mM a pH 4.5, esto llevó a una acidificación citoplasmática, con una subsecuente alcalinización hasta el pH interno inicial luego de 2 minutos. Por otro lado, para la cepa mutante, los valores internos de pH se mantuvieron a los mismos niveles que el pH externo cuando la fuente de carbono fue adicionada (es decir, 4.5). Estos niveles de pH internos no pudieron ser contrarrestados aun cuando las células fueron sujetas a un pulso de glucosa, en contraste con lo que se observó en la cepa salvaje, para la cual, una alcalinización adicional del pH citoplasmático fue alcanzado. Sin embargo, si el pH intracelular de la cepa mutante puede elevarse luego del pulso de piruvato luego de adicionar álcalis a la cubeta, esta cepa puede volver a responder al pulso de glucosa, es decir se puede llegar a un pH tal que la glicólisis pueda ser activada. Como un ensayo control, las dos cepas fueron expuestas a un pulso de glucosa 3 mM, mostrando los mismos niveles de alcalinización en ambos casos. Estos resultados muestran la importancia de la alcalinización interna llevada adelante por la utilización del piruvato a través de la vía C4, de manera que lo vuelve capaz de poder activar la glicólisis en estas condiciones. Complementamos los datos experimentales con un análisis genómico de diferentes cepas de L. lactis para obtener un conocimiento más profundo de las vías productoras de compuestos C4. Para esto realizamos un análisis a escala genómica de ocho cepas de L. lactis de diferentes nichos con el objetivo de analizar si esta vía estaba conservada. De estos estudios concluimos que, los genes requeridos para la síntesis de compuestos C4 están conservados en L. lactis, sin embargo, hay una gran variabilidad genómica entre los microorganismos estudiados. Todos estos datos sugieren que la vía de producción de C4 estaba presente antes de la diferenciación entre las subespecies lactis y cremoris. Basándonos en el hecho que la cepa IL1403 es derivada de una cepa diacetyilactis y tiene conservado el contexto génico ampliamente caracterizado para la cepa CRL264 (cepa diacetylactis modelo), especulamos que dos eventos genéticos diferentes ocurrieron durante el proceso evolutivo para la adquisición del cluster para la fermentación del citrato (característica relevante de la biovar). Primero, se observa la inserción del cluster cit adyacente al gen als. El operón cit es inducido a bajo pH y los productos de estos genes llevan a la degradación del citrato lo que conlleva una acumulación de piruvato. Ese evento genético podría haber sido provocado a través de la recombinación mediada por un transposón, ya que se encuentran secuencias de inserción completas y parciales que flanquean en las cepas IL1403 y CRL264. Segundo, estas cepas podrían haber adquirido recientemente un gen plasmídico codificante para un transportador de citrato, CitP (el plásmido de 8,5 kbp: pCit264 en la cepa CRL264 o pIL2 en la cepa IL594, de la cual deriva la cepa IL1403). Estos resultados parciales serán profundizados en posteriores análisis. En conclusión, todos estos resultados demostramos que el metabolismo de piruvato a bajo pH requiere una proteína ALS funcional, porque esta vía está interconectada y es clave para la homeostasis a pH ácido. En la segunda parte de esta tesis secuenciamos, ensamblamos, depuramos, anotamos y analizamos la secuencia genómica de la cepa Lactococcus lactis subsp lactis biovar diacetylactis CRL264, aislada de queso regional del Noroeste Argentino, un microorganismo modelo en lo que respecta al transporte y metabolismo de citrato y la producción de C4. Realizamos un análisis genómico comparativo entre las cepas de L. lactis y desarrollamos un enfoque filogenómico propio con el fin de clasificar correctamente a nuestra cepa, superando los problemas asociados a la designación de especies y subespecies en el grupo Lactococcus lactis. Para esto último comenzamos aplicando métodos conocidos (ANI, Tetra y isDDH) y luego desarrollamos un enfoque propio basado en herramientas de aprendizaje automático (“machine learning “). Las funciones a todos los CDS de las todas las secuencias utilizadas en esta tesis de L. lactis fueron asignadas base sobre la base de datos de OrthoMCL-DB y el algoritmo OrthoMCL. Las funciones biológicas de las proteínas fueron inferidas por correlación con su asignación de grupo ortólogo usando el software OrthoMCL. La cepa CRL264 comparte 992 funciones con el resto de las cepas diacetylactis. De esas funciones, 11 son específicas de la biovariedad, siendo la capacidad de metabolizar el citrato el único rasgo metabólico que comparten todas las cepas reportadas como diacetylactis. La asignación y confirmación de la identidad de la cepa CRL264 se realizo calculando el ANI (Average Nucleotide Identity) entre todas las cepas de L. lactis y nuestra cepa utilizando el software JSpecies con el algoritmo BLAST. Luego se calculó el porcentaje de genes compartidos con función similar. También se realizó hibridación ADN-ADN in silico (is-DDH) de la cepa CRL264 vs todas las cepas de L. lactis encontrando que nuestra cepa presenta valores muy altos de ANI vs las cepas reportadas como diacetylactis (LD61, IL1403, TIFN4 y TIFN6) a excepción de la cepa diacetylactis GL2. Valores menores al 95% se consideran especies diferentes, por lo que nuestro resultado pone en cuestión la idea de que cremoris y lactis sean dos subespecies, sino que los resultados sugerirían que podrían considerarse especies diferentes. El análisis clonal se realizó utilizando un esquema MLST (Multilocus sequence typing) los resultados mostraron que hay una identidad del 100% para 6 genes del esquema validado paras todas las cepas reportadas como diaceylactis, menos para la GL2. Es decir, las cepas CRL264, LD61, TIFN2 y TIFN4 son clonales de la cepa IL1403 (Anexo 3), a excepción de la cepa GL2. Luego se decidió construir un árbol filogenético que resuelva algunos problemas presentes como la presencia de genes adquiridos horizontalmente y las diferencias en las tasas de evolución desarrollando un esquema MLSA (Multilocus Sequence Analysis). Con el objetivo de filtrar los genes adquiridos horizontalmente posteriormente a la especiación, incluimos para definir este núcleo de genes a la especie L. graviae. El núcleo de genes resultante fue de 170 genes se utilizaron en el análisis. Se observó nuevamente que nuestra cepa L. lactis CRL264 pertenecen a una rama clonal de las subespecies L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, incluida la cepa IL1403, LD61, TIFN2 y TIFN4, a excepción de la cepa diacetylactis GL2. Los resultados también vuelven a sugerir que lactis y cremoris podrían ser consideradas dos especies diferentes en lugar de subespecies. Un nuevo esquema MLSA basado en 10 genes fue definido aplicando una metodología aprendizaje automático. Para eso decidimos evaluar el desempeño de cada gen individual para la clasificación en las especies utilizando el algoritmo bosques aleatorios (“Random Forest”). Así pudimos generar un ranking de los 170 genes, ordenados por importancia, es decir, en función de su capacidad de clasificar con menos error. Luego, concatenamos las secuencias de los 10 genes más importantes y ejecutamos un nuevo árbol filogenético con todas las cepas. El método mostró que era capaz de reproducir la topología anterior basada en 170 genes. Finalmente, se análizó comparativamente las características de la cepa L. lactis subsp lactis biovar diacetylactis CRL264. Se predijeron cinco islas genómicas (Gis) en GI I encontramos los genes del profago ps1 y un represor putativo del bacteriófago blL310; en el GI II, los genes del profago pi1 y una proteína de reparación del ADN recombinante RecT; en la isla GI III encontramos una enolasa putativo y una proteasa dependiente de ATP Clp; lo más interesante de la GI IV es que está flanqueado corriente abajo por el operón citrato; y GI V contiene un amplio conjunto de proteínas ribosomales. Como la cepa CRL264 resultó muy similar en el contenido génico a la cepa modelo IL1403 se decidió hacer un análisis comparativo más profundo entre las dos cepas revisando manualmente la sintenia en los genes que son más importantes para la adaptación a diferentes nichos, como por ejemplo, los elementos móviles o genes específicos necesarios para la adaptación al ambiente lácteo. En la gran mayoría de las secuencias de inserción la sintenia es similar (es decir, cada secuencia de inserción tiene un contexto génico idéntico y en regiones similares en ambos genomas) pero también observamos que algunas secuencias de inserción se perdieron en la cepa CRL264. No encontramos secuencias de inserción conocidas que estén en sólo la cepa CRL264 y no en la cepa IL1403. También se encontraron movilizaciones como es el caso de IS904C, o fragmentaciones, recombinaciones y la movilización a diferentes regiones cromosómicas tales como el IS981I, en el que un fragmento del gen y su contexto corriente arriba se moviliza en el cromosoma, pero el otro fragmento no se moviliza y retiene su contexto génico corriente abajo. El operón para la metabolización de agmatina y generación de putrescina está interrumpido en la cepa CRL264 y la oligoendopeptidasa F tiene un contexto diferente. Un análisis posterior debería evaluar si estos reordenamientos tienen influencia en la funcionalidad de los genes. Los profagos presentes en las cepas CRL264 e IL1403, están conservados en posiciones similares y en contenido génico los profagos bIL310, bIL386 y bIL311. El profago bIL312 está ausente en CRL264. Además, en la cepa CRL264 se detectaron otros dos fagos diferentes pero incompletos.