Reacción acrosómica y glicosidasas acrosomales en espermatozoides de Bufo arenarum

La reacción acrosómica es un requisito para que ocurra la fecundación. En anfibios este proceso es poco conocido debido a que la alta fragilidad del espermatozoide en numerosas especies dificulta el análisis. Sin embargo, en Bufo arenarum esta gameta posee una alta resistencia que permite utilizarlo como modelo de estudio. En este trabajo de tesis se describen: A) Métodos para la evaluación de la ruptura acrosomal en espermatozoides de Bufo arenarum. B) Estudio de las glicosidasas asociadas al espermatozoide. C) Caracterización de la NAcGlcasa en relación al proceso de fecundación. A. Evaluación de la ruptura acrosomal en espermatozoides de Bufo arenarum. En Bufo arenarum el acrosoma es más pequeño que en la mayoría de las especies informadas y la única forma de visualizarlo era mediante técnicas de microscopía electrónica. Este método es dificultoso, costoso y no puede utilizarse para el análisis de un gran número de espermatozoides. En este trabajo se han presentado diferentes métodos para evaluar el estado acrosomal en esta especie. Sólo mediante la tinción con Coomassie se ha podido detectar por microscopía óptica el perforatorium en algunos espermatozoides reaccionados. El uso de la lectina de Arachis hypogaea (PNA) marcada fluorescentemente permitió diferenciar “espermatozoides intactos” de los que habían sufrido la reacción acrosómica. Sin embargo, cuando se trabaja con sapos recolectados en verano, los patrones de tinción con la lectina no son tan claramente distinguibles. El método de la inmunocitoquímica es el de elección para detectar la reacción acrosómica. La técnica es sencilla y sensible. Tiene la ventaja que puede usarse en presencia de los componentes de la matriz extracelular de los ovocitos para estudiar los roles de éstos en la fecundación y fundamentalmente sus efectos en el espermatozoide. Por otro lado, mediante la utilización de la técnica de inmunofluorescencia se han establecido las mejores condiciones para la inducción de la reacción acrosómica. La incubación durante 20 minutos en un medio hipotónico induce la ruptura en el 70% de los espermatozoides. Sin embargo, cuando el ionóforo 20µM durante 45 minutos sería el tratamiento de elección ya que es más eficiente y los resultas son más reproducibles. B. Glicosidasas asociadas al espermatozoide. Actividades NAcGlcasa, N-AcetilGalactosaminidasa, β-Galactosidasa, β-Glucosidasa, α-Manosidasa, α-Glucosidas y α-Fucosidasa fueron detectadas en el espermatozoide de Bufo arenarum, siendo la NAcGlcasa la mayor de las actividades medidas. Todas estas glicosidasas pertenecen a entidades proteicas diferentes a excepción de las actividades de NAcGlcasa y N-Acetilgalactosaminidasa que parecen estar relacionadas a la misma proteína. Los estudios de la distribución subcelular de las distintas glicosidasas revelaron que la mayor actividad detectada para cada una de ellas está en la fracción de MA. Sin embargo, en el espermatozoide reaccionado se encontró el 10% de la actividad total de NAcGlcasa. Por otro lado, en la fracción que corresponde a las vesículas acrosomales se detectó actividad α-manosidasa. Mediante experimentos in vitro, se vio que NAcGlcasa es la única de las seis glicosidasas anteriormente mencionadas que interacciona con la EV de los ovocitos de la misma especie en condiciones que simulan el medio de fecundación. C. Caracterización de la enzima NAcGlcasa Estudios en otras especies de Anfibios anuros revelaron que los restos NAcGlc del ovocito podrían estar implicados en la interacción con el espermatozoide. La NAcGlcasaes la mayor actividad glicosidasa detectada en espermatozoides de Bufo arenarum. Además, la enzima se une in vitro a la EV sugiriendo algún rol en el proceso de fecundación. Debido a estas consideraciones se comenzó con el estudio de la glicosidasa. La enzima fue parcialmente purificada a partir de espermatozoides mediante cromatografías de interacción hidrofóbica y de afinidad en una matriz de ConA. La fuerte unión de la NAcGlcasa a estas matrices permiten sugerir que la enzima posee dominios hidrofóbicos y restos manosa en su composición. La muestra parcialmente purificada fue utilizada para analizar diferentes propiedades cinéticas y bioquímicas. El pH óptimo es 3,6 y la actividad se inhibe total y reversiblemente a pHs superiores a 8,0. Cuando se estudió el efecto de la temperatura, se vio que la actividad aumenta hasta alcanzar un máximo a 55ºC. Además, la enzima posee la ventaja de ser estable a 4ºC durante varios días, este hecho facilitó la manipulación. Las propiedades cinéticas descriptas muestran que la Vmax aparente es 3,18 ± 0,10 (U/mg) y la Km para el p-nitrofenil NAcGlc es 0,25 mM ± 0,04. Los azúcares NAcGlc y NAcGal son potentes inhibidores de tipo competitivo, siendo la Ki para NAcGal 1,5 mM. Los análisis de los requerimientos catiónicos mostraron que el aumento de la concentración tanto de Ca2+como de Mg2+ en el medio de reacción resultó en un igual aumento de la actividad. La purificación de la enzima a homogeneidad se realizó a partir de un hígado de machos de Bufo arenarum debido a que se disponía de cantidades limitantes de la enzima de origen espermático. Las enzimas de ambas fuentes poseen propiedades bioquímicas y cinéticas comparables. Las enzimas de ambas fuentes poseen propiedades bioquímicas y cinéticas comparables. El protocolo de purificación requiere únicamente de dos pasos. Luego de realizar una corrida electroforética en condiciones nativas, se cortó la banda en donde se detectó la actividad y finalmente la enzima fue purificada mediante una cromatografía de afinidad con una matriz ConA. El análisis electroforético en condiciones reductoras de la enzima purificada reveló que posee un masa molecular aparente de 45 kDa. Esta misma banda es detectada en las muestras de homogenado de hígado y de espermatozoides en análisis por Inmunodetección usando los anticuerpos anti- NAcGlcasa. Más aún, los análisis mediante exclusión molecular en HPLC muestran un pico de actividad a 45 kDa y otro a 190-200 kDa sugiriendo que la enzima pueda ser un tetrámetro constituido por subunidades de 45 kDa. La reacción acrosómica permite la liberación de las enzimas acrosomales y expone la membrana interna acrosomal. La NAcGlcasa de Bufo arenarum es la mayor actividad medida en el contenido acrosomal pero también se detectó actividad de esta glicosidasa asociada al espermatozoide reaccionado. Se ha analizado la participación de la NAcGlcasa en la fecundación mediante experimentos in vitro. La inhibición de la enzima por la adición de anticuerpos anti- NAcGlcasa reduce el porcentaje de ovocitos fecundados en comparación con los controles. Para corroborar que este bloqueo no es simplemente estérico, se agregaron al medio de fecundación NAcGlc o NAcGal, que tienen un efecto inhibitorio de la actividad enzimática, y en estos casos también se observó una fuerte inhibición de la fecundación. Finalmente, el tratamiento de los ovocitos con la enzima purificada provocó prácticamente una inhibición completa de la fecundación. En resumen, la enzima NAcGlcasa es la glicosidasa con mayor actividad detectada en el espermatozoide de Bufo arenarum. A pesar que el rol preciso de la enzima no se conoce, se detectó que interacciona con la EV. Dado que la inhibición de la enzima implica una inhibición de la fecundación se sugiere que la NAcGlcasa juega un papel importante en la fecundación de Anfibios.