Estudio de la metalo-beta-lactamasa anclada a membrana NDM-1 y análisis de su evolución clínica

Los carbapenemes son potentes antibióticos β-lactámicos, reservados como drogas de último recurso para el tratamiento de infecciones severas o por parte de organismos resistentes. Desafortunadamente, la creciente prevalencia en las últimas dos décadas de organismos con resistencia a estas drogas, en particular de las Enterobacterias Resistentes a Carbapenemes (CRE), constituye una seria amenaza a la efectividad del uso terapéutico de los mismos. El principal mecanismo de resistencia a carbapenemes es la producción de carbapenemasas, β-lactamasas capaces de degradar el antibiótico e inactivarlo. De acuerdo a su mecanismo catalítico se distinguen dos tipo de estas enzimas: las serín-β-lactamasas que utilizan un residuo de serina en su sitio activo para formar un intermediario covalente con el antibiótico y luego hidrolizarlo, y las metalo-β-lactamasas (MBLs), que utilizan iones Zn(II) para posicionar el sustrato y generar el hidroxilo que actúa como nucleófilo, sin formación de un intermediario covalente. NDM-1 es una de las MBLs de relevancia clínica de más reciente aparición. Desde su identificación en el año 2008, se ha expandido con gran rapidez a nivel mundial, y ya ha sido detectada en más de 70 países. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Hasta el momento se han descripto 19 variantes naturales de NDM, las cuales difieren entre sí por un número reducido de mutaciones puntuales. La presencia de Zn(II) en el sitio activo de las MBLs es indispensable para su funcionamiento. El espacio periplasmático, donde actúan estas enzimas en Gramnegativos, carece de mecanismos capaces de mantener la homeostasis de este metal, por lo que el Zn(II) disponible para las MBLs se encuentra directamente ligado a su concentración extracelular. Esto adquiere importancia durante una infección, dado que el sistema inmune utiliza la respuesta de Inmunidad Nutricional para restringir la disponibilidad de Zn(II) y otros cationes metálicos para el patógeno invasor. Como parte de este mecanismo, los neutrófilos liberan en los sitios de infección grandes concentraciones de calprotectina (CP), una proteína capaz de quelar con alta afinidad Zn(II) y Mn(II). En el presente trabajo de tesis se estudió el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la capacidad de conferir resistencia de las MBLs. En particular, se evaluó el efecto del anclaje a membrana de NDM-1 sobre las propiedades de la enzima, haciendo foco en su tolerancia a baja disponibilidad de Zn(II). Además, se buscó evaluar qué características de la enzima se encuentran bajo presión de selección mediante un análisis comparativo de sus alelos clínicos. Para determinar el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la funcionalidad de las MBLs, se compararon las resistencias de células de E. coli productoras de las MBLs de mayor relevancia clínica (NDM-1, VIM-2, IMP-1 y SPM-1) en medio de crecimiento suplementado con distintas concentraciones del quelante ácido dipicolínico (DPA). Si bien la resistencia de todas las MBLs se vio reducida gradualmente por adición de cantidades crecientes de DPA, se observó que distintas MBLs presentaban distintos grados de susceptibilidad a la limitación de Zn(II). Se encontró además que la adición de quelantes al medio de crecimiento lleva a la degradación de las MBLs, debido a que las formas desprovistas de metal de las mismas son más sensibles a la proteólisis. Se construyeron mutantes solubles de NDM-1 para analizar cómo afecta el anclaje a membrana las propiedades de la enzima. Si bien estas variantes eran activas y brindaban niveles de resistencia similares a los de NDM-1 salvaje en medio rico, resultaban más sensibles a la reducción en los niveles de Zn(II) extracelulares, y eran degradadas más rápidamente que la enzima salvaje cuando perdían metal. Por lo tanto el anclaje a membrana en NDM-1 contribuye a la adaptación de la enzima a baja disponibilidad de Zn(II), incrementando su estabilidad frente a la proteólisis. La caracterización de los primeros 16 alelos clínicos de NDM-1 demostró que no existen diferencias importantes entre los mismos en cuanto a la resistencia que otorgan en medio de cultivo rico con elevada disponibilidad de Zn(II), en concordancia con reportes previos. Sin embargo, las propiedades de los alelos difieren marcadamente bajo limitación de Zn(II), y gran parte de ellos tienen mayor capacidad de conferir resistencia bajo estas condiciones respecto a NDM-1. Asimismo, muchos de los alelos presentan mayor estabilidad in vivo que NDM-1, observándose los mayores incrementos en esta propiedad a causa de las mutaciones A233V y E152K. Por otro lado, la mutación más frecuente entre los alelos, M154L, contribuye a la adaptación de la enzima a condiciones de baja disponibilidad de Zn(II) mediante el incremento en la afinidad de unión de este metal. Se comprobó también que la localización de NDM-1 en la membrana externa incrementa su secreción a OMVs respecto a las formas solubles de la enzima. Las OMVs (vesículas de membrana externa) son partículas esféricas formadas a partir de protrusiones de la membrana externa de Gram-negativos, que se escinden y liberan de la célula generando una vesícula cerrada rodeada de membrana externa y que contiene en su lumen componentes periplasmáticos. Las OMVs son producidas por todas las bacterias Gram-negativas, bajo todas las condiciones de crecimiento, y se encuentran asociadas a una amplia variedad de procesos tales como adquisición de nutrientes, formación de biofilms, comunicación celular, resistencia a antibióticos y patogénesis. Se encontró que las OMVs que transportan NDM-1 poseen actividad β-lactamasa, y que son capaces de proteger a células sensibles a antibióticos β-lactámicos de la acción de los mismos. Además, la caracterización de OMVs generadas por distintos aislamientos clínicos productores de NDM-1 demostró que estas vesículas pueden contener la enzima así como el gen codificante para la misma. Las OMVs por lo tanto podrían haber contribuido a la rápida diseminación de NDM-1 a nivel mundial.