Biología celular del proceso de internalización endocítica de transportadores hepatocelulares canaliculares en colestasis por estrógenos

El estradiol-β-D-glucuronido (E17G) es un metabolito endógeno del estradiol cuyos niveles plasmáticos aumentan durante el embarazo, habiendo sido postulado como responsable de la patogénesis de la colestasis intrahepática que ocurre en las mujeres susceptibles embarazadas. La administración de E17G a ratas hembras produce una colestasis dosis-dependiente, aguda y reversible, afectando las fracciones dependientes e independientes de sales biliares del flujo biliar. nuestro grupo demostró que la alteración secretora bibliar inducida por E17G en la rata es críticamente dependiente de la endocitosis de transportadores hepatocelulares canaliculares claves para la formación de bilis, como Bsep Mrp2. Asimismo demostramos que este fenómeno está mediado por la activación de varias vías de señalización intracelular, como aquellas dependientes de REα-cPKC-ERK1/2, PI3K-Akt-p38MAPK y GPR30-AC-PKA. Sin embargo, el mecanismo involucrado en la endocitosis de los transportadores canaliculares es desconocido, y su esclarecimiento representa el objetivo principal de esta tesis. En una primera etapa, y ante la necesidad de contar con un modelo hepatocelular polarizado para el estudio de estos mecanismos, hemos validado el cultivo primario de hepatocitos de rata en sándwich de colágeno (CPHS) para el estudio de drogas que afectan la formación de bilis a través de la inducción de endocitosis de transportadores canaliculares. Tratando los CPHS con los agentes coléstasico E17G y taurolitocolato, así copmo con el compuesto colerético y anticolestásico DBAMPc, demostramos la utilidad de este modelo in vitro para detectar y cuantificar cambios en la secreción canalicular tanto de tipo colestásico como colerético, así como los cambios en la localización intracelular de transportadores canaliculares causales de dichas alteraciones funcionales. En la segunda etapa, el uso de inhibidores especificos de las vías endocíticas depenmdientes de clatrina y de caveolinas en duplas aisladas de hepoatocitos aportó evidencia preelimiar que E17G induce la endocitosis de Bsep y Mrp2 por un mecanismo dependiente de clatrina. Se obtuvo evidencia adicional de este mecanismo en hígados aislados y perfundidos, donde un inhibidor especifico de esta vía endocítica, monodansilcadaverina, previno la caída en el flujo biliar y la excreción biliar de sustrato de Bsep y Mrp2, así como la endocitosis de dichos transportadores evaluada por microscopía confocal. A modo confirmatorio de la dependencia de clatrina en la endocitosis de estos transportadore inducida por E17G, observamos que el bloque de esta vía mediante knock-down por RNA interferente de la expresión de AP2 (componente clave de la maquinaria endocítica dependiente de clatrina) en CPHS, llevó a una prevención completa de la función de transporte y de la endocitosis Bsep y Mrp2. En forma adicional, demostramos que E17G altera la localización de membrana de estos transportadores (originalmente enriquecidos en microdominois raft, ricos en colesterol y caveolina), llevando a un enriquecimiento de los mismos en microdominios canaliculares ricos en clatrina (no rafts), desde donde puede producirse la endocitosis dependiente de la misma. Por ultimo, como una primera aproximación a la identificación de los blancos celulares de aquellas proteínas quinasas activadas por E17G que conducen en última instancia a la endocitosis dependiente de clatrina de los transportadores canaliculares, se realizaron estudios de fosfoproteómica para identificar proteínas que modifiquen su grado de fosforilación frente al tratamiento con este estrógeno. Esto llevo a la identificación de numerosas proteínas que incrementan su fosforilación por E17G, dejando abierta así la posibilidad de realizar experimentos tendientes a evaluar su posible rol como intermediarios entre las vías de señalización pro-colestásicas y el proceso final de endocitosis de transportadores canaliculares conducente a la alteración colestásica.