Propiedades de multicelularidad de Bacillus subtilis y sus aplicaciones en el desarrollo de inoculantes para el agro

Primera Parte: La henificación, en sus distintas variantes, es la principal forma de conservar alfalfa pura o consociada. Existen dos formas principales de conservación del forraje: la henificación y el silaje. El primero actúa, principalmente, por deshidratación y el segundo por acidificación. La principal variable que se debe controlar en el proceso de henificar forraje, es la humedad. La reducción drástica de la humedad resulta clave una vez que el forraje ha sido cortado y conduce a la conservación de una mayor proporción del valor nutritivo original al conservar más hojas que tallos en el heno, reduciendo así la proliferación de diversos microorganismos contaminantes principalmente hongos indeseados. Para llevar a cabo esta primer etapa del trabajo, de índole aplicada, se realizó un aislamiento de cepas de Bacillus con alta capacidad esporulante, provenientes de distintas fuentes naturales como ser muestras henos de diferentes calidades y tierras de regiones cultivadas de la zona pampeana de nuestro país. De aquí se obtuvieron aproximadamente una 500 cepas del género Bacillus, las cuales fueron estudiadas en sus capacidades para controlar el crecimiento de distintas cepas fúngicas contaminantes típicos de henos y que producen grandes pérdidas de calidad de los forrajes, lo que se traduce en pérdidas económicas para el productor animal. Esto se ve reflejado luego en una disminución de la calidad de la carne y una menor producción de leche. Las cepas fúngicas que más interesaron controlar fueron Fusarium verticilloides, Aspergillus flavus, Mucor sp y Penicillium sp. Otro parámetro que se estudió para realizar una selección tentativa de las cepas que constituirán un futuro producto comercial fue su capacidad de deshidratar alfalfa. Para ello desarrollamos ensayos novedosos de deshidratación de alfalfa, que en conjunto con los ensayos de actividad antifúngica, permitieron seleccionar cuatro cepas salvajes de Bacillus. Estas cepas, se estudiaron en cuanto a su capacidad de desplazarse en medios semi-sólidos, el cual es un parámetro asociado a la capacidad de colonizar diversos nichos, que en nuestro caso sería la superficie de las hojas de alfalfa, su capacidad de esporular, el cual es un factor clave al momento de la producción industrial y por último su capacidad de formar biofilms, la cual está asociada a la producción de sustancias bio-activas. Además, se estudió la capacidad de las esporas de las cepas de Bacillus seleccionadas para llevar a cabo un ciclo de vida completo sobre el tejido vegetal: germinacióncrecimiento vegetativo-esporulación-germinación. Finalmente, las cepas seleccionadas fueron escaladas a nivel piloto en fermentadores, secuenciadas para conocer su identidad de especie exacta. Estos estudios, en conjunto, ermitirán el patentamiento, con propiedad intelectual de la UNR y el CONICET, y la formulación y registro del producto comercial por parte de BIOTAY S.A. en el SENASA. Segunda Parte: Diversas cepas de Bacillus han sido usadas como organismo modelo para el estudio en el laboratorio de numerosos aspectos biológicos y fisiológicos como ser división celular, competencia genética, formación de la espora y producción antimicrobianos. Estos estudios han considerado al bacilo como entidad individual, siendo tratados como organismos aislados y separados de su entorno. Sin embargo, en los últimos años ha resultado de fundamental interés el estudio de las bacterias como organismos de comportamiento multicelular ya que, paradójicamente, el mundo de las bacterias contiene numerosos ejemplos de este tipo de comportamiento comunitario, tales como la formación de biofilms, la formación de cuerpos fructíferos y el desplazamiento cooperativo sobre superficies. En ambientes naturales, el cooperativismo entre las células le brindaría a la población bacteriana una ventaja adaptativa muy importante. En este trabajo de Tesis, en una segunda instancia, nos hemos abocado al estudio y caracterización de uno de los comportamientos sociales de movimiento sobre superficies menos estudiados y por ende muy poco comprendido que son capaces de llevar a cabo ciertas bacterias en ambientes tanto naturales como en el laboratorio. Este tipo de movimiento es el sliding o deslizamiento, un tipo de deslizamiento independiente del flagelo. Para llevar a cabo estos estudios escogimos a Bacillus subtilis, bacilo Gram-positivo formador de esporas, como modelo de estudio. Empleamos dos cepas de Bacillus, una fue la cepa salvaje NCIB3610 relacionada con la cepa Marburg, la cual está reportada como capaz de desplazarse por medio de sliding y de swarming. El sliding es definido como una translocación “pasiva” sobre la superficie que sería impulsada por el crecimiento cooperativo de las células y facilitada por la producción de surfactante. Mientras tanto, el swarming se define como un movimiento multicelular activo y coordinando de las bacterias a través de las superficies accionado por los flagelos. La otra cepa escogida fue la cepa salvaje de origen japonés Bacillus subtillis natto (RG4365), la cual es utilizada para la preparación de una comida funcional probiótica típica nipona. Esta última cepa es totalmente inmóvil en medio líquido pero, por lo demostrado en este trabajo de Tesis, es capaz de desplazarse en medio semisólido. En una primera instancia se determinó la razón por la cual una de tales cepas era móvil en medio líquido y la otra cepa no. Se sospechaba que la cepa RG4365, no oseía flagelo. Por lo tanto se procedió, como una primera instancia evaluativa, a realizar un ensayo de tinción de flagelos a partir de células incubadas tanto en medio semi-sólidos como en medio de cultivo líquido. Este ensayo reveló que la cepa RG4365 no los poseía, mientras que la cepa NCIB3610 sí, por lo tanto se pudo determinar, en principio, que el movimiento que presenta la cepa nipona en medio semi-sólido sería del tipo sliding. Al medir la velocidad del desplazamiento sobre superficies de ambas cepas se encontró que la cepa RG4365 se movía aunque más lentamente que la cepa NCIB3610. A continuación y para confirmar nuestra presunción, se inactivó el gen hag, el cual codifica la subunidad de la flagelina en B. subtilis. Se pudo observar que ambas cepas se movían en el medio semi sólido, pero no en medio líquido, mediante sliding y a la misma velocidad. Un análisis posterior de los posibles reguladores del sliding demostró que el regulador maestro de la transcripción Spo0A era el responsable del sliding en ambas cepas salvajes. Spo0A, es el responsable de muchos de los comportamientos sociales o de adaptación de B. subtillis como ser el gatillado de la esporulación, la síntesis de ácidos grasos durante la diferenciación celular, la formación de biofilm pero no así del swarming. Se determinó mediante distintas construcciones génicas que los genes relacionados con el inicio de la esporulación no estaban implicados en el deslizamiento mientras que, AbrB, un represor de la formación de biofilm y de la expresión de genes relacionados con la adaptación a la fase estacionaria, estaba implicado parcialmente junto con Spo0A en la regulación del sliding, ambos como represores y activadores, respectivamente. Para profundizar nuestro estudio se realizó un análisis de transcriptómica donde se evaluaron los genes que se expresaron en distintas condiciones de incubación de tanto cepas salvajes como de mutantes en spo0A, en condiciones permisivas y no permisivas para el desplazamiento (sliding). Este estudio reveló que en condiciones permisivas de sliding se activaban genes relacionados con la formación de biofilm como por ejemplo tasA, epsG, bslA. También se determinó que el lipopéptido urfactina era un componente indispensable para el sliding. Además, se sobre-expresaban genes relacionados con la síntesis de ácidos grasos (AG) como ser fabF, fabHBA, fabG, no así genes relacionados con la degradación de AG, sugiriendo que se requeriría para el sliding de la síntesis de AG de novo. Mediante un análisis del perfil de AG que se realizó en distintas condiciones permisivas y no permisivas de sliding se pudo determinar que la composición de la membrana lipídica del bacilo varía pese a que la temperatura permanecía constante. Se registró una disminución de la síntesis de AG lineales y aumentó el contenido de AG ante-iso de bajo punto de fusión, que le estaría brindando a la membrana una mayor fluidez para que la célula, en ausencia de la fuerza propulsora del flagelo, pudiese desplazarse de manera comunitaria a través de superficies a 37 °C, temperatura en la cual la síntesis de AG insaturados se encuentra inhibida. Puesto que en este punto ya hemos podido determinar cuál es el regulador de respuesta responsable del deslizamiento y los genes necesarios para llevarlo a cabo, nos propusimos estudiar, si hubiese, la señal que gatillaba el movimiento. Como se mencionó en párrafos anteriores, Spo0A es el regulador de respuesta responsable del sliding, el cual es activo en su forma fosforilada (Spo0A-Pi). Este fosfato es adquirido por Spo0A a partir de una posta de fosfatos conocida como phosphorelay. El phosphorelay es un sistema de transducción de señales similar a un sistema de dos componentes pero expandido, el cual está compuesto por cinco quinasas ensoras (KinA-E). Se sabe que cualquiera de las cuatro quinasas KinA, KinB, KinC o KinD (hasta el momento no hay ningún fenotipo reportado para KinE) detectan iferentes señales ambientales, se autofosforilan a partir de ATP y luego transfieren ese grupo fosfato, en primer instancia a Spo0F, que a su vez pasa su grupo fosforilo a Spo0B, el cual transfiere el fosfato a Spo0A, volviéndola activa. Para llevar a cabo el estudio sobre cuál/es quinasa/s serían las responsables del deslizamiento, en primer lugar se evaluó la capacidad de deslizarse de las cepas mutantes en la síntesis de cada una de las quinasas y se encontró que dos de ellas estaban implicadas en el sliding, KinB y en menor grado KinC. Está reportado que las quinasas del phosphorelay se encuentran divididas en sus funciones en grupos de redundancia donde KinA y KinB son las principales quinasas asociadas a la esporulación, mientras que KinC y KinD son las principales responsables de la formación de biofilm. Ahora, en base a nuestros estudios se adiciona otra dupla o dúo regulador, KinB/KinC, sobre el comportamiento social del sliding. Recientemente se reportó que KinB a través de su segundo segmento transmembrana está asociado con los citocromos caa3 y bc, cumpliendo de esta manera, un rol en el sensado del estrés nutricional dentro de un biofilm maduro. Sin embargo, descartamos la hipótesis de que la función que cumple KinB en el sensado del estrés nutricional esté relacionada con el sliding puesto que a medida que la colonia se expande sobre el medio de cultivo fresco los requisitos nutricionales estarían satisfechos y no se lo podría equiparar con el estilo de vida de las células “compactadas y mayormente inmóviles” dentro de un biofilm en cuya parte más íntima escasearían los nutrientes y el oxígeno activando estas señales a KinB. Por otro lado, se conoce que el potasio (K+) cumple un rol inhibitorio sobre la actividad estimuladora de la formación del biofilm de KinC al interactuar con su dominio PAS-PAC. La surfactina producida durante la formación del biofilm actuaría como molécula quelante del potasio intracelular liberando, de esta manera la inhibición producida por el K+. Además, se sabe que la concentración intracelular del ion mencionado disminuye a medida que la célula alcanza la fase estacionaria. Otros estudios, analizaron las características de la formación de la colonia en un biofilm sólido de B. subtillis en medios definidos con y sin K+ y se encontró que en medios depletados del metal, las colonias (biofilms) se desarrollaron en forma de dendritas. En nuestros estudios, cuando se analizaron las características de las cepas mutantes en las quinasas se pudo apreciar, en principio como una curiosidad, que todas las mutantes en kinB formaban colonias estrelladas y con mayor predisposición a formar biofilm que la cepa salvaje. A posteriori demostramos la existencia de una estimulación del sliding dependiente de la concentración de K+ que no se presentaba en cepas deficientes en kinB. Estos resultados, nos indicaron la estimulación positiva que el potasio tiene sobre esta quinasa KinB. Con los resultados hasta aquí obtenidos, nos avocamos al estudio de la estructura de KinB y su posible relación con el potasio. Para esto, se analizaron las estructuras típicas de proteínas sensoras de potasio o que lo unen, en particular los canales de potasio presentes tanto en eucariotas como en procariotas. De este análisis surgió una posible región, que no poseen ninguna de las otras quinasas del phosphorelay, que se encuentra solapada con el sitio de unión a ATP de la quinasa KinB en la región citoplasmática, la cual posee una alta similitud con la secuencia de aminoácidos consenso de la región filtro o dominio selectivo de unión de potasio conservada en todos los canales de potasio conocidos a la fecha. A partir de este hallazgo, se realizaron diferentes mutaciones puntuales sobre el gen kinB en la región codificante para el supuesto sitio de reconocimiento de K+ que posee la quinasa KinB y se estudió su efecto sobre el sliding. Estas mutaciones deberían no afectar la capacidad de esporular, de manera de saber que la mutante en KinB es activa en esporulación, y poder evaluar qué ocurriría con la activación del sliding. Verificada esta hipótesis, es decir que los mutantes en KinB con el sitio de selectividad para potasio mutados, no activaban el sliding y eran totalmente inmóviles, pero sí esporulaban, pudimos proponer un nuevo rol de KinB, junto con KinC, como las quinasas reguladoras del movimiento social tipo sliding a través del sensado de la fluctuación de potasio intracelular en distintas regiones (centro y periferia) que se da durante la expansión (sliding) de la colonia. Nuestra hipótesis, avalada por resultados experimentales de índole genética y fisiológica no descriptos en este resumen, propone que existe una regulación espacio-temporal de las quinasas en una colonia en deslizamiento activo. En un principio, cuando la colonia está compuesta por unas pocas células, la concentración intracelular de potasio es alta y está siendo sensada por KinB, que además, es la quinasa que se expresa primero permitiendo la activación del sliding y la inhibición por potasio del biofilm dependiente de KinC. A medida que la colonia se va desarrollando, KinC se expresa a mayores niveles, pero sigue inhibida en la periferia de la colonia en expansión por la presencia del K+ pero ya no así en el centro de la colonia donde las células se encontrarían en fase logarítmica tardía y por ende las concentraciones de potasio disminuirían por la presencia de surfactina y tansportadores de K+ activos que expulsarían el catión al medio extracelular. Esto último libera a KinC de su inhibición e inicia la formación de biofilm en el centro de la comunidad bacteriana, dejando las células en expansión en los bordes de la colonia, con KinB siendo estimulada por potasio para seguir avanzando en búsqueda de nuevos nichos. A tiempos mayores de incubación, en el centro de la colonia, donde se formó el biofilm, los nutrientes comienzan a escasear, el estrés nutricional continúa aumentando hasta llegar a niveles de activación de KinA, lo cual permite la formación de cuerpos fructíferos donde finalmente las células esporulan. Los resultados de esta investigación son altamente novedosos ya que describen un mecanismo cooperativo de movilidad social, el sliding, presente no solo en Bacillus sino también en varios patógenos productores de enfermedades infecciosas relevantes (Tuberculosis, Lepra, Ántrax, etc). Hemos identificado los componentes estructurales (BslA, Fas, TasA, EPS) de la maquinaria del mismo, los genes reguladores implicados en el mismo (Spo0A Y AbrB) y su forma de regulación (phosphorelay) identificando los sensores (KinB Y KinC), la señal (potasio intracelular) y la manera en que funciona (regulación espacio-temporal a través de la unión al sitio de selectividad de KinB y la región PAS-PAC de KinC). Además nuestros resultados podrían tener una relevancia importante en la determinación del comportamiento de los Bacilli en la naturaleza, donde deben colonizar nuevos nichos desplazándose de un lugar a otro, por ejemplo en la zona de la rizósfera de las plantas. Relacionado a esto, es de amplio conocimiento el uso de B. subtilis como agente de biocontrol a través de la producción de sustancias bio-activas y su reconocido uso en la agroindustria como inoculante o promotor del crecimiento vegetal. Precisamente, el desarrollo de esta beca Doctoral se llevó a cabo en el marco de un proyecto co-financiado con la empresa BIOTAY S.A. a través de un convenio de transferencia tecnológica tipo PID, entre la UNR, la empresa BIOTAY S.A., el FONCyT y el Conicet, donde el objetivo es desarrollar un producto comercial de base biotecnológica formulado con cepas del género Bacillus autóctonas para el mejoramiento de forrajes conservados (henos) destinados a la alimentación animal.