Caracterización bioquímica y funcional de enzimas glucosídicas involucradas en la fecundación de vertebrados

La fecundación es un proceso complejo que requiere de múltiples eventos coordinados que llevan a la fusión del espermatozoide con el ovocito. Algunos de estos eventos requieren de interacciones proteína-carbohidrato. Una amplia evidencia experimental, obtenida en distintas especies, sugiere que glucosidasas de la superficie del espermatozoide podrían actuar a modo de lectina reconociendo azúcares específicos de la envoltura de los ovocitos (zona pelúcida en mamíferos o envoltura vitelina en anfibios) facilitando la unión de los gametos durante la fecundación. Además de este rol, se ha propuesto que glucosidasas del ovocito, que son liberadas luego de la fecundación, actuarían sobre los azúcares de las glucoproteínas que conforman su envoltura, modificando los sitios de unión al espermatozoide y contribuyendo de este modo con el bloqueo de la polispermia. La presencia de glucosidasas se ha reportado en los gametos de casi todas las especies de vertebrados estudiadas. Entre ellas, la enzima de origen lisosomal N-acetil--D-glucosaminidasa (EC 3.2.1.52), que metaboliza residuos de N-acetil glucosamina y/o N-acetil galactosamina terminales desde glucoconjugados, ha sido ligada tanto a la unión de las gametos como a la prevención de la polispermia en diversas especies de animales. En los anfibios, se ha informado que una Hex presente en los gránulos corticales de los ovocitos de X. laevis es liberada durante la reacción cortical (Greve y col., 1985), y que hidroliza residuos N-acetil glucosamina terminales de ZPC (Vo y col., 2003), una de las glucoproteínas que componen la envoltura vitelina (EV) de los ovocitos. La hidrólisis de estos residuos inhibe la fecundación, sugiriendo que los mismos actuarían como receptores espermáticos y que la Hex estaría asociada al bloqueo de la polispermia (Hedrick, 2008). Sin embargo, hasta el momento no se ha descripto la estructura molecular de ninguna Hex de anfibio, ni se han caracterizado las isoformas presentes en sus gametos. Por otra parte, son escasas las evidencias experimentales sobre el rol de la Hex en la fecundación en otras especies de anfibios. En este trabajo de tesis, utilizando secuencias conservadas de la región N-terminal, central y C-terminal de Hexs caracterizadas en mamíferos, se logró identificar la secuencia de ADNc de una putativa Hex de X. laevis a partir de una biblioteca de transcriptos. El ORF completo contenido en este ADNc se secuenció a partir del clon XL250c11ex obtenido del Instituto Nacional de Biología Básica de Japón (NIBB) y la secuencia se anotó en el GenBank (n° acceso JN127371). El ORF secuenciado (1662 pb) codificó un polipéptido de 553 residuos de aminoácidos. Estudios realizados in silico permitieron verificar que este polipéptido presenta una alta homología con las subunidades de Hexs previamente caracterizadas (>56 % identidad aminoacídica) y que conserva todos los residuos de aminoácido que conforman el sitio activo de las Hexs. La identidad Hex de esta proteína fue confirmada por la transfección del ADNc JN127371 en células de ovario de hámster chino (CHO). Estudios de Western blot, utilizando anticuerpos -Hex desarrollados en esta tesis, permitieron verificar la expresión de un polipéptido del tamaño esperado en los extractos celulares totales provenientes de las células transfectadas. Además, estos extractos mostraron un aumento de su actividad Hex cuando fueron comparados con los extractos provenientes de cultivos transfectados con un plásmido control. El gen codificante para la Hex caracterizada fue identificado en X. tropicalis. El estudio de su secuencia y la comparación por homología con ADNcs de ORF completo, tanto de X. laevis como de X. tropicalis, permitió predecir que dos Hexs distintas podrían ser originadas desde él, por medio del splicing alternativo de dos de sus exones. En los mamíferos, tres isoformas de la Hex (HexA, HexB y HexS) han sido caracterizadas, cada una compuesta por la homo o heterodimerización de dos subunidades distintas denominadas  y . Estas subunidades pueden diferenciarse por sus sitios activos (Lemieux y col, 2006) y fue encontrado que están codificadas en genes separados que se cree que evolucionaron desde un gen ancestral común (Proia, 1988). El estudio de los sitios activos de las dos Hexs generadas por splicing alternativo a partir del gen caracterizado en Xenopus, y su comparación con los de las subunidades  y  que constituyen las Hexs de humano, mostró que una de estas Hex presenta un sitio activo de tipo , mientras que la otra presenta un sitio activo de tipo . Esto sugiere que en los anfibios las distintas isoformas de la Hex podrían generarse por splicing alternativo desde un mismo gen; a diferencia de los mamíferos donde se generan por subunidades codificadas en genes separados. Este hallazgo nos permitió hipotetizar, que el splicing alternativo pudo ser un mecanismo ancestral para la generación de las distintas isoformas de la Hex antes de que el gen ancestral de la Hex se duplicara y divergiera durante el curso de la evolución. Utilizando anticuerpos específicos obtenidos a partir de la expresión transgénica en E. coli de un fragmento N-terminal de la Hex codificada en el ADNc JN127371 se inmunocaracterizaron las Hexs presentes en los ovocitos de R. arenarum. La Hex fue encontrada tanto en el interior del citosol como en los gránulos corticales de los ovocitos. Esta localización fue confirmada por estudios de actividad enzimática realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato. La Hex de gránulos corticales fue liberada al espacio perivitelino durante la reacción cortical permitiendo suponer su participación en el bloqueo de la polispermia. En los espermatozoides de R. arenarum la Hex fue encontrada en las membranas apicales (plasmática y/o acrosomal externa) provenientes de la cabeza, en el contenido acrosomal y en los espermatozoides reaccionados. Estos hallazgos permiten suponer que la Hex de espermatozoides podría estar vinculada a la unión inicial de los gametos, y que podría participar en el pasaje del espermatozoide reaccionado a través de la EV del ovocito. El rol biológico de la Hex, y de otras glucosidasas, en la fecundación de R. arenarum, fue estudiado mediante ensayos de fecundación in vitro y experimentos de unión de espermatozoides a EVs aisladas. En estos ensayos se demostró que la inhibición de la Hex con el inhibidor específico competitivo 2-acetamido-2-deoxi-D-glucono-1,5-lactona disminuyó la tasa de fecundación de los ovocitos, de manera concentración dependiente. Además, tanto este inhibidor, como el pretratamiento de las EVs aisladas con una Hex comercial pura, fueron capaces de inhibir la unión de los espermatozoides a la EV, demostrando que la Hex presente en los espermatozoides de R. arenarum está involucrada en la unión primaria con el ovocito, reconociendo alguno de sus azúcares sustrato en la EV. Experimentos realizados con p-nitrofenil azúcares sustrato, mostraron que la fucosidasa es la principal actividad glucosídica en los gránulos corticales de los ovocitos de R. arenarum, permitiendo suponer su participación en la prevención de la polispermia. La adición de fucosa como azúcar competidor en los ensayos de fecundación in vitro redujo significativamente la tasa de ovocitos fecundados. Sin embargo, la adición de fucosa no interfirió la unión de los espermatozoides a las EVs asiladas. Estos resultados sugieren que la fucosidasa participa en alguna de las etapas del proceso de fecundación de R. arenarum, pero no en la unión de los gametos a nivel de la EV.