Bioingeniería de sensores biológicos. Aplicaciones en salud y biología sintética

Los receptores de membrana traducen estímulos ambientales extracelulares en señales químicas intracelulares. Fallas en la señalización, provocadas por respuestas pobres o exacerbadas, pueden poner en riesgo la vida de la célula u organismo. Dado que la mayoría de las enfermedades presentan alguna disfunción en rutas metabólicas mediadas por receptores transmembrana, hay un gran entusiasmo e interés en identificar nuevos blancos de medicamentos, basándose en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la transducción de señales de receptores claves, que en su mayoría son proteínas de membrana con actividad quinasa. Los abordajes para estudiar receptores de membrana se han focalizado en el dominio extracelular o en el dominio intracelular. A pesar de que el péptido inmerso en la membrana lipídica constituye un paso obligado en la señalización, poco se sabe de su mecanismo biofísico-molecular. En este trabajo de tesis, estudiaremos el rol del Segmento Transmembrana (STM) en la transducción de señales de dos quinasas: DesK e Ire1. DesK es la quinasa encargada de mantener la homeostasis de Bacillus subtilis frente a cambios en la fluidez de su membrana, como por ejemplo debido a descensos en la temperatura. Esta posee cinco STM y un dominio catalítico citoplasmático (DesKC). Su regulación fisiológica muestra que a menor temperatura presenta mayor actividad. Por el contrario, una variante de DesK que carece de la región transmembrana activa la ruta metabólica independientemente de la temperatura, con mayor actividad a 37°C que a 25°C, mostrando una regulación invertida respecto a DesK. Para dilucidar cómo la región transmembrana de DesK controla al dominio catalítico, trabajamos con una variante trunca que contiene el quinto segmento transmembrana fusionado a DesKC (TM5-DesKC), la cual es inactiva a cualquier temperatura, y le introdujimos residuos que pueden generar enlaces de tipo puente hidrógeno interhelicoidales en una cara de la hélice que ya contiene tres residuos de serina (aminoácido formador de un puente hidrógeno interhelicoidal). Con esta estrategia, evidenciamos que el fortalecimiento de esta cara del STM activa al sistema a bajas temperaturas. Además, al introducir estos residuos en la cara opuesta, totalmente hidrofóbica, la actividad y regulación del sensor se modulan: variantes con residuos formadores de puente hidrógeno interhelicoidales en la cara opuesta a la cremallera de serinas presentan mayor actividad a mayor temperatura. Debido a que la construcción TM5-DesKC no es funcional sin el agregado extra de residuos formadores de puente hidrógeno interhelicoidales, deducimos que la interacción con los otros STM de DesK es necesaria para su actividad y adecuada regulación fisiológica. Para entender cómo funciona DesK con sus cinco STM, diseñamos un sistema de coexpresión que permite estudiar las interacciones in vivo entre hélices de DesK. Este sistema nos permitió demostrar cómo las interacciones interhelicoidales transmembrana contribuyen a la transmisión de la señal. Finalmente, nos preguntamos si los puentes hidrógeno estarían involucrados en la regulación de sensores de membrana en otros organismos. Para validar el principio fisicoquímico hallado en DesK, analizamos el caso de Ire1, una quinasa con relevancia clínica. Ire1 contiene un único STM y se ubica en la membrana del retículo endoplásmico de todas las células eucariotas. A través de una serie de mutaciones en el STM de Ire1 y medidas de actividad, mostramos que los aminoácidos formadores de puente hidrógeno interhelicoidales son críticos para la actividad de la proteína. De esta forma, proponemos que la cremallera de este tipo de residuos en distintos STM permite modular la actividad enzimática: diferencias en la posición de los puentes hidrógeno conlleva a diferentes conformaciones de los dominios citoplasmáticos catalíticos.