Participación de residuos aromáticos en la estructura y función de flavoproteínas

La ferredoxina-NADP+ reductasa presente en organismos fotosintéticos (FNR plastídica) es una flavoproteína de 35 kDa que cataliza el transporte reversible de electrones entre NADP(H) y ferredoxina o flavodoxina. La FNR plastídica es el prototipo de una superfamilia estructural que incluye proteínas de funciones diversas. Su estructura terciaria consta de un dominio amino terminal para la unión de una molécula del grupo prostético FAD y un dominio carboxilo terminal para la unión del sustrato NADP+. En todas las secuencias conocidas de FNR plastídicas se encuentran dos residuos tirosina estrictamente conservados que resultan homólogos a los residuos en posición 89 y 308 en la FNR de hojas de arveja, éste último ubicado en el extremo carboxilo terminal de la proteína. Las estructuras cristalográficas de la enzima muestran que estas tirosinas se ubican a ambos lados de la flavina del FAD. Hasta el presente no existía información directa acerca de la geometría de unión de la parte nicotinamida del sustrato NADP+ a la enzima. En este trabajo de Tesis se empleó a la FNR de hojas de arveja como modelo para estudiar la importancia evolutiva, funcional y estructural de los residuos aromáticos conservados en el entorno de la flavina de las flavoproteínas pertenecientes a la superfamilia estructural ferredoxina-NADP+ reductasa. Se estudió la evolución de la ferredoxina-NADP+ reductasa mediante técnicas de Filogenia Molecular. Con este fin se construyeron árboles filogenéticos basados en las secuencias de aminoácidos de todas las enzimas plastídicas (FNR) y proteobacterianas (FPR) disponibles en las bases de datos. El análisis evolutivo de las FPRs permitió validar una clasificación de la flavoproteína en tres subtipos: subtipo E. coli, subtipo A. vinelandii y subtipo A. actinomycetemcomitans. Los subtipos propuestos se distinguen por particularidades en la secuencia del extremo carboxilo terminal, que incluye al residuo homólogo a la tirosina 308 de FNR de arveja. La caracterización de mutantes de FNR fusionadas a GST permitió estudiar el papel desempeñado por el residuo tirosina 89 en la estructura y función de FNR de arveja. Se demostró que la aromaticidad de la cadena lateral de la tirosina 89 resulta importante para la fijación del grupo prostético, con una contribución menor del puente de hidrógeno que forma el grupo hidroxilo del residuo con el ribitilo del FAD. Esta última interacción sería indispensable para definir una conformación adecuada que permita el acercamiento de la cadena lateral de la lisina 110 al puente pirofosfato del NADP+, ya que la sustitución de la tirosina 89 por fenilalanina disminuyó dramáticamente la afinidad por este sustrato. La aromaticidad del residuo en posición 89 no es el único requerimiento para mantener una geometría compatible con la transferencia de hidruro, ya que la sustitución del mismo por triptofano afectó profundamente la capacidad catalítica de la enzima. Se dilucidó el modo de unión productivo del sustrato NADP+ a FNR, mediante el estudio cristalográfico de los mutantes FNR Y308S y FNR Y308W de la enzima de arveja en complejos con NADP(H). La sustitución del residuo tirosina en posición 308 produjo un aumento de la estabilidad de la interacción de la nicotinamida en el sitio activo, no afectó la geometría de unión del NADP(H) y mantuvo la efectividad de la catálisis. Se demostró la existencia de un determinante adicional que contribuye a la capacidad de discriminación entre los sustratos NADP(H) y NAD(H) por parte de FNR. El sitio de unión para el 2'-fosfato del piridín nucleótido realiza el reconocimiento específico y establece fuertes interacciones con el grupo diferencial. El determinante adicional está constituido por la tirosina 308, cuya cadena lateral compite por la misma ubicación en el sitio activo con la nicotinamida, grupo que es común a NADP(H) y NAD(H). En FNR silvestre ambos determinantes contribuyen para alcanzar una preferencia NADPH/NADH de 37100. La anulación del determinante adicional en la mutante FNR Y308S ocasiona una disminución de 500 veces en la preferencia de la enzima por NADPH. El estudio ab initio de un sistema que modeló las interacciones entre la isoaloxazina y las cadenas laterales de las tirosinas 89 y 308 de FNR de arveja, permitió concluir que el ángulo diedro isoaloxazina-fenol en la geometría de mínima energía estaría determinado principalmente por la separación interplanar entre las dos moléculas. Se propone que el grupo de residuos cisteína 266, glicina 267 y leucina 268 impondría una cota a la separación interplanar entre la flavina y la cadena lateral de la tirosina 308, disminuyendo la estabilidad de la interacción entre ambas moléculas.