Desarrollo de métodos analíticos luminiscentes en combinación con métodos quimiométricos : aplicaciones alimenticias y biomédicas

En química analítica se pueden utilizar datos de diferentes estructuras dimensionales para realizar una calibración, es decir, datos puntuales o de orden cero, datos vectoriales o de orden uno y datos matriciales o de orden dos. Al emplear datos de orden dos, es posible obtener la denominada ventaja de segundo orden, que permite la cuantificación del analito en presencia de interferentes y que no han sido modelados en la etapa de calibración. Los algoritmos quimiométricos que presentan la ventaja de segundo orden, dependiendo de su fundamento, pueden clasificarse de la siguiente manera: 1) Modelos basados en un ajuste por cuadrados mínimos alternantes (ALS), como el análisis paralelo de factores (PARAFAC), algunas de sus variantes como PARAFAC2 (que permite variaciones de perfiles en una de las dimensiones entre muestra y muestra) y PARALIND (PARAFAC para sistemas con dependencia lineal), y la resolución multivariada de curvas acoplada a ALS (MCR-ALS). 2) Modelos basados en el uso de variables latentes para el calibrado, como la regresión en cuadrados mínimos parciales desdoblados (U-PLS), multi-vía (N-PLS), siempre y cuando sean combinados con la bilinealización residual (RBL) para proveerles la ventaja de segundo orden. Cuando se procesan datos de segundo orden para un conjunto de muestras, es importante determinar si el arreglo tridimensional formado por dichos datos cumple o no con la llamada condición de trilinealidad. Una posible causa de desvío de la trilinealidad es el alto (o total) solapamiento de perfiles en una de las dimensiones. Cuando este solapamiento se presenta entre un analito calibrado y un interferente, los dos únicos algoritmos capaces de lograr la ventaja de segundo orden son MCR-ALS y PARALIND, mientras que PLS/RBL fallará, dado que la técnica RBL es incapaz de distinguir entre analito e interferente. Sin embargo, en esta Tesis se presenta un nuevo modelo U-PLS/RBL, en el que el procedimiento de RBL está modificado para incluir dependencia lineal (RBL-LD). Este reciente algoritmo ha demostrado ser capaz de resolver el problema del solapamiento total, con resultados analíticos similares a los logrados con MCR-ALS y PARALIND. En primer lugar, se desarrolló un método para la determinación de ácido benzoico en muestras reales de jugos de frutas en presencia de una interferencia, la sacarina. Se emplearon matrices de excitación-tiempo de decaimiento de luminiscencia sensibilizada de lantánidos, datos de segundo orden no utilizados hasta el momento, para obtener la ventaja de segundo orden aplicando técnicas quimiométricas, tales como PARAFAC y N-PLS/RBL. Para ello, las matrices de excitación-tiempo de decaimiento se midieron para un conjunto de calibración que contenía al analito, ácido benzoico, en un rango de concentraciones desde 0,00 hasta 5,00 mg L–1, para un conjunto de validación que contenía al analito y a la interferencia, sacarina, en un rango de concentraciones desde 0,00 hasta 6,00 mg L–1, y para muestras reales de jugos de frutas que contienen ácido benzoico y sacarina. Los resultados obtenidos indican una mejor habilidad de predicción con N-PLS/RBL que con PARAFAC, como puede verse al comparar las concentraciones predichas con las concentraciones nominales del analito en las muestras de validación, y con los resultados provistos por el método de referencia (HPLC) en las muestras reales. En una segundo etapa se analizaron datos de segundo orden con solapamiento extremo en una de las dimensiones entre el analito y el interferente. A diferencia de otros algoritmos de calibración de segundo orden, MCR-ALS puede resolver convenientemente este problema analítico, empleando matrices aumentadas en el modo de la dimensión que presenta poca selectividad. Se analizaron un conjunto de datos simulados y también un sistema experimental que involucra la determinación de carbidopa en presencia de un potencial interferente, la levodopa. Ambos compuestos reaccionan con cerio (IV) para producir la especie fluorescente cerio (III), presentando diferentes cinéticas. Se midieron las matrices de emisión en función del tiempo para un conjunto de calibración que sólo contiene al analito de interés, en este caso la carbidopa en el rango 0,00-0,50 mg L-1 y para un conjunto de validación que contienen a ambos componentes, el analito analizado y la potencial interferencia, levodopa, en el rango de 0,00-1,20 mg L-1. Como los espectros de emisión producidos por ambos sistemas son idénticos, la cuantificación de carbidopa en las muestras de validación sólo fue posible usando MCR-ALS en el modo de aumentación espectral. Tanto en el sistema simulado como en el experimental, los resultados obtenidos indican una buena respuesta analítica, a pesar del gran solapamiento espectral y de la presencia de constituyentes inesperados en las muestras de prueba. En presencia de interacciones entre el analito y el fondo de la muestra, y ante una señal de fondo significativa, se requiere tanto de la calibración multivariada de segundo orden como de adición de patrón para lograr la cuantificación del analito aprovechando la ventaja de segundo orden. La adición de patrón corrige las variaciones de señal producidas por interacción con el fondo de la matriz, y la calibración de segundo orden permite la cuantificación en presencia de interferentes. En esta Tesis se presenta un método modificado de adición de patrón de segundo orden, en el cual la matriz de datos de la muestra incógnita se sustrae digitalmente de las matrices obtenidas luego de la adición de patrón, y cuya cuantificación procede mediante una calibración externa clásica. Con el fin de evaluar este nuevo método de adición de patrón, se analizaron sistemas que requieren adición de patrón con los diferentes algoritmos quimiométricos de segundo orden. Este nuevo modo de adición de patrón permitiría no sólo aplicar PARAFAC y MCR-ALS, sino también PLS/RBL en sus dos versiones. La comparación de los algoritmos de segundo orden se llevó a cabo empleando un conjunto de datos simulados y dos sistemas de datos experimentales. En los sistemas experimentales se determinó salicilato en suero en presencia de naproxeno y danofloxacina en suero en presencia de salicilato, empleando matrices de excitación-emisión de fluorescencia como datos de segundo orden. Los rangos de concentraciones finales para los analitos estudiados fue desde 0,00 hasta 0,60 mg L-1 para el salicilato y desde 0,00 hasta 55,0 ng L-1 para la danofloxacina. Estos rangos de concentraciones están dentro de los valores terapéuticos de las drogas estudiadas en suero. Tanto los datos simulados como los experimentales indican que U-PLS/RBL y N-PLS/RBL pueden ser aplicados para la calibración con adición de patrón. Sin embargo, los mejores resultados se obtuvieron con N-PLS/RBL, que son comparables a los obtenidos por los algoritmos clásicos como PARAFAC y MCR-ALS. También se utilizó el nuevo método de adición de patrón para sistemas que presentan solapamiento extremo en una de las dimensiones de los datos. En primera instancia se analizó un conjunto de datos simulados y luego sistemas experimentales en los cuales se determinaron tres antibióticos fluoroquinolónicos (ciprofloxacina, norfloxacina y danofloxacina) en suero y en presencia del interferente salicilato. Para esto se procesaron datos matriciales de luminiscencia sensibilizada de lantánidos: matrices de excitación-tiempo de decaimiento de los correspondientes complejos con terbio (III). Los rangos de concentraciones finales para cada analito analizado fueron los siguientes: desde 0,00 hasta 0,24 mg L-1 para la ciprofloxacina, desde 0,00 hasta 0,20 mg L-1 para la norfloxacina y para la danofloxacina, y del potencial interferente, salicilato, desde 4,00 hasta 12,00 mg L-1. En estos sistemas experimentales, las señales de segundo orden del complejo analito-lantánido y del interferente-lantánido presentan perfiles de tiempo de decaimiento muy similares. Por lo tanto, MCR-ALS es una de las pocas metodologías que permite aprovechar la ventaja de segundo orden, ya que permite romper la colinealidad en una de las dimensiones de los datos recurriendo a la matriz aumentada, haciendo posible la cuantificación del analito en presencia de interferentes, cuando los perfiles en uno de los modos están fuertemente solapados. Tanto los datos simulados como los experimentales demostraron que MCR-ALS puede implementarse exitosamente usando datos de adición de patrón en modo 2 o modificado para sistemas con solapamiento extremo en una de las dimensiones de los datos. Finalmente, se desarrolló un nuevo procedimiento de RBL-LD, que incluye la dependencia lineal causada por el solapamiento extremo en una de las dimensiones de los datos, el cual se implementó acoplado a U-PLS. La nueva propuesta se aplicó exitosamente a un sistema de datos simulados y a dos sistemas experimentales. El primer sistema experimental analizado corresponde a datos matriciales quimioluminiscentes de segundo orden para la determinación de ciprofloxacina en muestras de orina en presencia de la interferencia producida por el fondo de la muestra de orina. Estos datos están basados en la reacción de quimioluminiscencia del analito con tris (2,2’-bipiridil) dicloro-rutenio (II) y cerio (IV) en medio ácido y no han sido descriptos hasta el momento. Los cuales comprenden como primera dimensión la señal del tiempo de evolución de quimioluminiscencia del complejo de rutenio y como segunda dimensión el espectro de emisión quimioluminiscente del rutenio, que es común a todos los constituyentes, y además requirieren de adición de patrón. El rango de concentración estudiado del analito está dentro de los valores terapéuticos de dicha droga en orina humana (0,00-180 mg L-1). El segundo sistema experimental evaluado involucra la determinación del antibiótico ciprofloxacina en suero en presencia de salicilato como interferente a partir de señales de luminiscencia sensibilizada de lantánidos. Este sistema experimental requiere de adición de patrón y ha sido previamente analizado empleando MCR-ALS. En esta ocasión se compararon los resultados obtenidos anteriormente con los obtenidos al utilizar PARALIND y el nuevo modelo U-PLS/RBL-LD. Los resultados obtenidos con este nuevo modelo U-PLS/RBL-LD son comparables a los de MCR-ALS y a los de PARALIND. Tanto el sistema simulado como los dos sistemas experimentales demostraron que el nuevo procedimiento de RBL-LD proporciona una buena interpretación analítica aprovechando la ventaja de segundo orden.