(FBIOyF) Posgrado - Tesis
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Examinando (FBIOyF) Posgrado - Tesis por Autor "Almada, Evangelina"
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Ítem Acceso Abierto Participación de AKAP350 en el establecimiento de la polaridad celular en estructuras epiteliales organotípicas y en la sinapsis inmunológica de células NK(2018) Almada, Evangelina; Larocca, María Cecilia; Zwirner, NorbertoAKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejos proteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi. AKAP350 está implicada en la regulación de la dinámica de los microtúbulos y participa en el desarrollo de la polaridad migratoria y la polaridad epitelial hepática. En este trabajo se analizó la participación de AKAP350 en el desarrollo de dos tipos de asimetría celular: la polaridad epitelial columnar y la sinapsis inmune. En una primera instancia utilizamos cultivos celulares 3D de células epiteliales para analizar la relevancia de AKAP350 en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad epitelial. Las células con expresión disminuida de AKAP350 (AKAP350KD) formaron quistes polarizados con una morfología anormal del lumen. La organización de células epiteliales en estructuras organotípicas con un único lumen requiere que las divisiones celulares se lleven a cabo en forma simétrica respecto al plano del epitelio. Aún no se han caracterizado completamente las vías de señalización que proveen conexiones moleculares entre regiones específicas de la corteza celular y los microtúbulos del huso mitótico, y que, por lo tanto, definen la orientación del huso mitótico. El análisis de las células mitóticas mostró que las células AKAP350 KD presentaron un alineamiento defectivo del huso mitótico. EB1 es una proteína asociada a los microtúbulos que participa en la regulación de la orientación del huso mitótico en células epiteliales. Nuestros hallazgos indicaron que AKAP350 colocaliza en los polos del huso con EB1. Los resultados del análisis de la distancia mínima entre ambas proteínas por FRET fueron compatibles con la interacción de ambas proteínas en dichas estructuras. Experimentos de co-inmunoprecipitación mostraron la interacción de EB1 con el dominio N- terminal de AKAP350, el cual es también el sitio de unión a la subunidad de la dinactina p150glued. La disminución de la expresión de AKAP350 generó una reducción de los niveles de EB1 en los polos del huso y en los microtúbulos del aster. El aumento en los niveles de EB1 en los polos mitóticos y en los microtúbulos del aster inducido por sobreexpresión de esta proteína compensó el efecto de la disminución de la expresión de AKAP350 sobre la orientación del huso. La deslocalización específica de AKAP350 del centrosoma, así como la interferencia en su interacción con EB1, indujeron fenotipos similares a los de AKAP350 KD, respecto tanto a la localización de EB1 como a la formación del lumen. En estas condiciones también se observó una disminución de los niveles de p150glued en los centrosomas y en los microtúbulos del aster. Concluimos que AKAP350 recluta a EB1 y p150 glued a los polos del huso, asegurando la presencia de estas proteínas en los microtúbulos del aster y una correcta orientación del huso mitótico durante la morfogénesis epitelial. Tanto EB1 como AKAP350 participan en la ruptura de la simetría durante el establecimiento de la sinapsis inmune en célulasT no citolíticas. En una segunda etapa, realizamos experimentos destinados a evaluar la participación de AKAP350 en el posicionamiento de EB1 durante la adquisición de asimetría celular asociada a la formación de la sinapsis inmune citolíticaen células natural killer (Nks). Inicialmente caracterizamos la presencia de AKAP350 en células YTS, una línea celular proveniente de células Nks. A partir de las mismas, se obtuvieron células con la expresión disminuida de AKAP350 (YTS AKAP350 KD). Se utilizó un modelo bien establecido de sinapsis inmune cultivando las células YTS en presencia de células derivadas de eritroleucemia (KT86). Hallazgos de nuestro grupo indicaron que AKAP350 participa en el desarrollo de la polaridad celular en este modelo. En dichas condiciones, utilizando microscopía confocal, se determinamos que AKAP350 modula la localización centrosomal de EB1. En conclusión, demostramos que AKAP350 modula el direccionamiento del huso mitótico en células epiteliales a través del reclutamiento de EB1 hacia los polos y, consiguientemente, hacia los microtúbulos asociados a estas estructuras. En forma similar, AKAP350 también recluta EB1 hacia el centrosoma durante el establecimiento de la sinapsis inmune citolítica en células NK. A través del reclutamiento de EB1 a los polos del huso mitótico, AKAP350 interviene en el mantenimiento de la polaridad epitelial planar. La relevancia de la interacción entre ambas proteínas en la reorganización de las estructuras subcelulares hacia el sitio de contacto con la célula blanco es un aspecto importante a investigar en futuros estudios.