(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Aislamiento y caracterización molecular de micobacteriofagos: sus aplicaciones al estudio y diagnóstico de micobacterias patógenas
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2015-03-13) Franceschelli, Jorgelina Judith; Morbidoni, Héctor Ricardo
En las últimas décadas el estudio de los bacteriofagos específicos de micobacterias-micobacteriofagos- se ha constituido en una pieza clave para los avances alcanzados en el estudio de la fisiología y genética de este género bacteriano, que comprende numerosas especias entre ellas patógenos que suponen una amenaza en salud pública como M. tuberculosis y M.leprae, agentes causales de las tuberculosis y la lepra respectivamente. Durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral se han aislado siete micobacteriofagos usando M. smegmatis como bacteria indicadora; los cuales junto a otros once micobacteriofagos aislados previamente en el mismo laboratorio de trabajo, han sido caracterizados fenotípicamente, en cuanto a su naturaleza lítica o temperada, su rango de huésped y sus características morfométricas. Algunos de ellos se han integrado con facilidad al cromosoma de M. smegmatis mientras que seis de los dieciocho micobacteriofagos en estudio fueron capaces de infectar M. tuberculosis. También, gracias a la secuenciación genómica de estos especímenes los mismos pudieron agruparse en distintas categorías definidas en la literatura, se determinaron el número de ORFs en cada caso, y la función probable para los mismos, cuando esta pudo ser asignada; este análisis permitió finalizar la secuenciagenimica para diez de ellos, las cuales han sido depositadas en Genbank. Inesperadamente en una alta proporción, estos aislamientos presentaron loci de partición, constituídos por los elementos ParA, ParB y ParS. Mediante un análisis filogenético de los mismos, y considerando la naturaleza temperada de los micobacteriofagos que poseen estos sistemas, es probable que dada la reticencia del género Mycobacterium al intercambio génico, sus virus hayan adquirido estos loci de partición como una alternativa para perpetuarse junto con las micobacterias sin “perturbar” su genoma. Por otro lado, en el marco de una colaboración establecida con el grupo del Dr. C. Martín (Universidad de Zaragoza, España), se ha construido una mutante en el ORF MSMEG_4724, codificante para una oligorribonucleasa hipotética (ORN) con actividad 3´-5´exonucleasa. La ausencia de la misma ha generado una reducción en la eficiencia de formación de placas de lisis para más de la mitad de los micobacteriofagos ensayados, bloqueando parcialmente el ciclo de replicación de los mismos en la etapa de inyección del material genético, y en algún otro punto que aún no pudo ser elucidado. Además, mediante el análisis de mutantes espontáneas resistentes a distintos micobacteriofagos, se han podido dividir a los aislamientos locales en dos grupos definidos, aquellos que usarían GPLs como moléculas receptoras, y un grupo mayoritario que fue capaz de replicarse en mutantes deficientes en estas moléculas, y por lo tanto tendrían preferencia por otro tipo de moléculas para iniciar la infección en M. smegmatis.
Acceso Abierto
Alteraciones de isoenzimas de citocromo P450 durante la regeneración hepatica : participación de putrescina
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2000-06-30) Favre, Cristian; Carrillo, María Cristina
El hígado es un órgano con una notable capacidad de regeneración que se manifiesta ante cualquier agresión sea ésta de origen tóxico, infeccioso o quirúrgico. La hepatectomía parcial en roedores es un incuestionable modelo para abordar el estudio del proceso regenerativo del hígado. La regeneración comienza con una serie de eventos que conducen al hepatocito a ingresar en la fase G1 del ciclo celular. Estos cambios iniciales incluyen la activación temprana de una serie de genes como c-myc, c-fos, c-jun y el gen odc. Los productos de estos genes son requeridos para la progresión del ciclo celular. odc codifica la enzima ornitina decarboxilasa, la primera de las enzimas de la vía sintética de las poliaminas y la limitante de esta ruta. Las poliaminas aumentan sus niveles durante cualquier proceso proliferativo en cualquier tipo de tejido. Poseen afinidad por moléculas nucleofílicas y posibilitan que aumente la velocidad de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. (...)
Acceso Abierto
Alteraciones hepatocelulares inducidas por estrés oxidativo: bases moleculares y papel de las cascadas de señalización
(2007) Pérez, Leonardo Martín; Roma, Marcelo Gabriel; Sánchez Pozzi, Enrique Juan
Numerosas patologías hepáticas poseen un componente oxidativo como parte de su mecanismo de daño tisular. El estrés oxidativo eleva los niveles citosólicos de Ca2+ y puede, potencialmente, activar una serie de eventos de señalización induciendo cambios morfológicos y funcionales que conducen, en última instancia, a la muerte celular. La comprensión de estos procesos es de suma importancia, ya que puede promover el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas con capacidad para prevenir, o mejor aún, revertir los daños al tejido hepático inducidos por estrés oxidativo. En este trabajo de tesis, se demostró la participación de proteína quinasa C (PKC) dependiente de Ca2+ en la disfunción biliar, y en la desorganización del citoesqueleto de actina y de las uniones estrechas, inducidos por el pro-oxidante modelo tert-butil hidroperóxido (tBOOH), utilizando el modelo de duplas aisladas de hepatocitos de rata. tBOOH (100 μM, 15 min) elevó los niveles de especies reactivas del oxígeno (ROS), indicado por el aumento en la lipoperoxidación (+186%, p < 0,05) y la producción ROS-dependiente de 2´,7´-diclorofluoresceína (+36%, p < 0,05). A su vez, generó un aumento en la concentración citosólica de Ca2+ (+100%, p < 0,05), y estimuló la translocación a membrana de la isoforma dependiente de Ca2+ de PKC PKCα como parámetro de su activación (+79%, p < 0,05). También, se observó una reducción en el número de duplas capaces de acumular y de retener (aprox. -50% en ambos parámetros, p < 0,05) en su vacuola canalicular el análogo fluorescente de sal biliar colil-lisil fluoresceína (CLF). Estos eventos se acompañaron de internalización de la bomba exportadora de sales biliares Bsep, redistribución de la proteína asociada a uniones estrechas ZO-1, desorganización de F-actina y formación de protrusiones de membrana (+285%, p < 0,01), este último un marcador precoz del daño estructural al citoesqueleto. Todos estos eventos fueron completamente prevenidos por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (20 μM), los inhibidores panespecíficos de PKC H7 (100 μM) y SP (10 μM), el inhibidor de isoformas de PKC dependientes de Ca2+ Gö6976 (2 μM) y el activador de PKA DB-AMPc (500 μM); PKA frecuentemente contrarregula los efectos de PKC. Por otro lado, una dosis mayor de tBOOH (500 μM, 15 min) indujo despolarización mitocondrial (aprox. +80%, p < 0,01), fenómeno asociado a la apertura de poros de transición de permeabilidad (PTPM), y aumento en la producción de ROS de origen mitocondrial (+1000% en los niveles de lipoperoxidación, p < 0,01). Estos eventos fueron prevenidos (aprox. –30%, p < 0,05) por el quelante de Ca2+ intracelular BAPTA/AM (50 μM), por los inhibidores de CaM W7 (100 μM) o trifluoperazina (TFP, 10 μM) y por el inhibidor de CaMKII KN-62 (10 μM); el nivel de prevención alcanzado fue similar al obtenido con el bloqueante de PTPM CsA (5 μM), indicando que la exacerbación del daño hepatocelular oxidativo, vía formación de PTPM, se encuentra mediada por la vía citosólica de señalización Ca2+-CaM-CaMKII. En conclusión, estos resultados indican que los ROS pueden ejercer efectos deletéreos en el hepatocito activando cascadas de transducción de señal, y no sólo actuando como efectores directos del daño oxidativo.
Embargo
Alteraciones moleculares de importancia diagnóstica y pronóstica en Trombocitemia Esencial (TE) y Mielofibrosis Primaria (MFP)
(2022) Ojeda, Mara Jorgelina; Pratti, Arianna Flavia; Calvo, Karina
Las neoplasias mieloproliferativas (NMP) constituyen un grupo heterogéneo de enfermedades clonales de la stem cell hematopoyética. Incluyen a policitemia vera, trombocitemia esencial (TE) y mielofibrosis primaria (MFP), cuya característica unificadora es la activación constitutiva de la vía de señalización JAK-STAT, impulsada por mutaciones drivers en JAK2, CALR y MPL. Estas mutaciones están directamente implicadas en el fenotipo mieloproliferativo, mientras las mutaciones no drivers, no son específicas de las NMP, pero contribuyen al fenotipo clínico y a la evolución de la enfermedad. La caracterización molecular de las NMP resulta importante tanto en el diagnóstico como en el pronóstico de estas patologías, así como en la identificación de marcadores que podrían ser considerados blancos terapéuticos, lo que representa una necesidad actual, principalmente en MFP. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue investigar la presencia y distribución de mutaciones de importancia diagnóstica en nuestra población de pacientes con TE y MFP, así como de mutaciones de relevancia pronóstica en MFP, contribuyendo así a una mejor caracterización biológica de estas patologías. Para la caracterización de las mutaciones drivers en la cohorte de pacientes con TE (n=258) y MFP (n=69) y de las mutaciones no drivers de High Molecular Risk (HMR) en los genes ASXL1, SRSF2, EZH2 e IDH1/2 en MFP (n=65), se emplearon o diseñaron técnicas de ARMS y ASO-PCR, secuenciación directa, así como también técnicas de screening por (high resolution melting) HRM y por electroforesis en poliacrilamida. Se identificaron mutaciones drivers en 86,4% y 88,4% de la cohorte con TE y MFP, respectivamente. En ambas patologías la mutación más frecuente fue JAK2 V617F (~60%), seguida de las mutaciones de CALR (~20-25%) y por último las de MPL (~5-10%). Las mutaciones HMR se detectaron en el 38,5% de los pacientes con MFP, el 27,7% con 1 y 10,8% con 2 mutaciones. Las mutaciones en ASXL1 (24,6%) fueron las más frecuentes entre los genes de HMR y las segundas más frecuentes, luego de JAK2 V617F. Las mutaciones de SRSF2; EZH2 y IDH2 se detectaron en 15,4%; 7,7% y 1,54% de los casos, respectivamente. La identificación de estas mutaciones en 37,5% de los pacientes triple negativos permitió confirmar la existencia de una proliferación neoplásica mieloide. Por otro lado, se correlacionó el perfil clínico y hematológico de los pacientes al diagnóstico con el estatus de las mutaciones drivers, observándose que la presentación clínica fue más heterogénea en TE que en MFP. En cuanto a las mutaciones de HMR, se asociaron al sexo masculino y a menores valores de hemoglobina. Por último, se analizó la supervivencia global en MFP, con el objetivo de determinar el impacto pronóstico de las mutaciones estudiadas. Las mutaciones de CALR se asociaron con un pronóstico favorable y las mutaciones de HMR en general, e individualmente las de ASXL1, SRSF2 y EZH2, con un pronóstico desfavorable. Los resultados obtenidos subrayan la importancia de la caracterización molecular en el diagnóstico y pronóstico de las NMP, así como también contribuyen a explicar la heterogeneidad clínica de estas patologías.
Acceso Abierto
Análisis de la expresión de proteínas de polaridad celular y su incumbencia en los procesos oncogénicos asociados a infecciones virales
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-23) Marziali, Federico Emanuel; Gardiol, Daniela
El mantenimiento de la polaridad celular representa un mecanismo de supresión oncogénica. La interferencia en la expresión de los factores que la regulan es un hecho evidente en la progresión de diferentes tumores. Es por ello que dichos factores constituyen un tema de estudio de gran relevancia. La proteína DLG1 es considerada como un regulador importante de polaridad, siendo capaz de formar complejos multiproteicos en dominios intracelulares específicos. De esta forma, DLG1 contribuye a la formación de las uniones intercelulares adherentes y además regula negativamente la progresión del ciclo celular. La expresión de DLG1 se encuentra afectada en gran medida durante la evolución tumoral, observándose cambios en sus niveles y en su localización subcelular. Al momento, el conocimiento de los mecanismos que regulan sus niveles de expresión es muy pobre e incierto. Dicho conocimiento representaría el punto de partida para la búsqueda de estrategias que permitan revertir los cambios observados. Por ello, parte de este Trabajo de Tesis Doctoral se dedicó al estudio de los mecanismos implicados en la definición de los niveles de DLG1 en contextos biológicos que requieren de una correcta expresión de esta proteína. En este sentido, estudiamos la implicancia de mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales, en especial un mecanismo de splicing alternativo descubierto en nuestro laboratorio que tiene lugar en la región 5´ no traducible (5´UTR) del ARN mensajero y es capaz de modular la abundancia de DLG1. Así, aplicando técnicas de cuantificación de transcriptos y de niveles proteicos, exploramos la participación de estos mecanismos bajo diversas circunstancias, como la adhesión celular y la progresión del ciclo celular epitelial, procesos donde DLG1 es particularmente importante. Además, analizamos la existencia del splicing en células provenientes de diversos tejidos pudiendo detectar a su vez la participación de este mecanismo en procesos de diferenciación celular. De este modo, logramos contribuir a la identificación de nuevos mecanismos de regulación para DLG1, los cuales podrían verse afectados en procesos tumorales. Determinados virus oncogénicos pueden tomar ventaja de los reguladores de polaridad para facilitar su ciclo de replicación interfiriendo con la polarización y contribuyendo a la transformación celular. Este es el caso de los virus del papiloma humano de alto riesgo oncogénico (HPV de alto riesgo), asociados estrechamente al desarrollo de carcinomas cervicales y de otros tumores; y del virus linfotrópico de células T del adulto tipo 1 (HTLV-1), considerado como el agente etiológico de la leucemia humana de células T (ATL). Estos virus, con ciclo replicativo diferentes, codifican para oncoproteínas denominadas E6 y Tax1 respectivamente, con actividades similares en cuanto a su capacidad para promover la proliferación celular. En las mismas resalta, sin embargo, la presencia de motivos C-terminales que les permiten interaccionar con reguladores de polaridad, dentro de los cuales se encuentra DLG1, siendo todavía incierta su función como partner de dichas proteínas virales. Por lo tanto, llevamos a cabo una serie de experimentos para profundizar en la significancia biológica de dichas interacciones. En este punto sobresalió la aplicación de la técnica de microscopía de fluorescencia FRET, capaz de detectar interacciones directas entre proteínas. Pudimos observar que la unión a DLG1 por parte de E6 y Tax1 puede implicar consecuencias diferentes, indicando que estos virus oncogénicos pueden hacer un uso distinto de sus partners de polaridad para favorecer su replicación y estimular la transformación celular. En este sentido, detectamos una interacción entre E6 y DLG1 en los bordes celulares y región citoplasmática con posibles consecuencias en la proliferación celular. Además, descubrimos la existencia de una relación dependiente de la abundancia relativa de cada proteína, lo que resulta en diferentes niveles de expresión para cada una de ellas. Estas observaciones contribuyen a comprender el significado biológico de las variaciones detectadas en la expresión de DLG1 durante la evolución de las lesiones cervicales asociadas a infecciones por HPV. En tanto, en relación a la asociación entre Tax1 y DLG1, pudimos detectar su ocurrencia en estructuras semejantes a compartimientos subcelulares definidos. En este caso, luego del análisis de una variedad de organelas celulares, evidenciamos que la asociación Tax1-DLG1 tiene lugar principalmente en la región perinuclear, co-localizando con marcadores del aparato de Golgi y del centrosoma. En dicha región Tax1 podría reclutar a DLG1 como mecanismo que impediría su tráfico a los bordes celulares o bien estimular su participación en mecanismos de traducción de señales, teniendo así una significancia oncogénica. Al mismo tiempo, conociéndose la polarización del centrosoma inducida por Tax1 necesaria para la transmisión del genoma de HTLV-1 a una célula no infectada, es posible que DLG1 pueda cumplir alguna función en dicho proceso. En resumen, teniendo en cuenta los datos alcanzados, este trabajo de Tesis Doctoral aporta al conocimiento integral de los mecanismos que regulan la expresión de DLG1 y además contribuye al entendimiento de la forma en que los HPV del alto riesgo y el HTLV-1 pueden utilizar o interferir con esta proteína de polaridad para promover funciones relacionadas a la transformación celular. Este trabajo también robustece la idea de la existencia de mecanismos comunes de patogénesis viral donde la asociación con proteínas de polaridad puede relacionarse con el ciclo de replicación y el desarrollo de patologías.
Embargo
Análisis de la farmacoterapia de un paciente VIH+ en tratamiento antirretroviral
(2022) Biscay, Alexis Fernando; Brandoni, Anabel
Objetivo: Realizar una evaluación de la farmacoterapia y analizar los Problemas Relacionados con los Medicamentos (PRM) en un paciente portador de VIH con antecedentes de múltiples esquemas antirretrovirales. Método: Se seleccionó un paciente de sexo femenino, 44 años con diagnóstico VIH positivo (VIH +) desde junio de 1993 con importante lipodistrofia y antecedentes de estar expuesto a múltiples esquemas antirretrovirales, registrado en el sistema de gestión de pacientes de la Dirección de Sida y Enfermedades de Transmisión Sexual (DSyETS) denominado SVIH. Se realizaron dos entrevistas al paciente donde, con el consentimiento de éste, se hizo un análisis retrospectivo de su historia terapéutica. Se analizaron los diferentes esquemas antirretrovirales evaluando los medicamentos administrados, dosis y duración del tratamiento. Posteriormente se realizó un análisis para detectar PRM. Resultados: Se realizó un análisis farmacoterapéutico retrospectivo a través de la historia clínica de una paciente ambulatoria VIH (+). Se detectaron algunos problemas relacionados a los medicamentos: PRM tipo 1, la paciente utilizaba esquemas antirretrovirales con menos fármacos que los recomendados, la recomendación actual es un mínimo de tres fármacos activos, es decir fármacos a los cuales el virus no haya generado resistencia; y PRM tipo 6 debido a la utilización de fármacos antirretrovirales con efectos adversos agudos y crónicos, algunos, como por ejemplo Zalcitabina no recomendados al día de hoy por su alta toxicidad, durante el historial terapéutico de la paciente. Conclusión: En función de los PRM detectados y teniendo en cuenta los problemas de adherencia que manifestó la paciente durante su historial terapéutico, en este trabajo se propone la posibilidad de administrar un nuevo tratamiento antirretroviral superador que podría evaluarse con el equipo médico que sigue a la paciente para tratar de mejorar tanto la adherencia como la calidad de vida de la paciente. Este nuevo esquema tendría que estar formado por fármacos que tengan menor capacidad para generar desórdenes metabólicos.
Acceso Abierto
Análisis de la formación de complejos insolubles entre polímeros de cadena flexible con carga eléctrica y tripsina : sus potenciales aplicaciones biotecnológicas
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-09-16) Braia, Mauricio Javier; Romanini, Diego
En la actualidad, la industria se ha convertido en un gran consumidor de enzimas ya que éstas permiten acelerar reacciones, disminuir los costos de producción, mejorar el rendimiento de un proceso industrial y hacer que el mismo se vuelva más amigable con el medio ambiente; entre otras ventajas. Las enzimas se utilizan en una gran variedad de industrias como la alimenticia, textil, papelera, cosmética, farmacéutica; ya sea en alguna etapa de un proceso (panificación, ablandamiento de cuero, blanqueo de papel, síntesis de drogas) o como componente de variados productos (cremas, medicamentos, detergentes). Así, surge la necesidad de disponer de grandes cantidades de enzimas y en algunos casos con altos grados de pureza. Esto ha estimulado la búsqueda de fuentes naturales de enzimas junto con el desarrollo de nuevas técnicas bioseparativas y el perfeccionamiento de la obtención de enzimas recombinantes. Gran parte de los procedimientos tradicionales de purificación de proteínas incluyen varias etapas de precipitación. Para mezclas con baja cantidad de contaminantes y alta concentración de la proteína de interés puede ser un método efectivo de concentración, y en algunos casos, puede actuar como etapa única de purificación, dependiendo del grado de pureza final pretendido. Una de las técnicas empleadas para la precipitación de enzimas es la formación de complejos insolubles con polímeros de cadena flexible cargados (polielectrolitos, PE). Estos complejos pueden separarse de los contaminantes por decantación y pueden utilizarse para purificar, concentrar, estabilizar e inmovilizar a la enzima de interés. Es una técnica simple, rápida, económica, aplicable a gran escala y en condiciones óptimas permite recuperar a la enzima casi en su totalidad (rendimientos superiores al 95 %). La precipitación por formación de complejos insolubles se basa en la interacción principalmente electrostática entre la enzima de interés y un PE. Esta interacción depende del pH, la fuerza iónica, la temperatura, el tiempo y la concentración de ambas especies. Por lo tanto, es necesario conocer las mejores condiciones para optimizar el mecanismo de formación del complejo insoluble. Además, resulta prioritario mantener la estabilidad estructural de la enzima y su actividad catalítica. En esta tesis se estudió la formación de complejos insolubles entre tres PE aniónicos: Eudragit® L-100 (EL100), Eudragit® S-100 (ES100) y alginato (ALG) y la tripsina (TRP), una enzima muy requerida en la industria. Los tres PE empleados se caracterizan principalmente por poseer subunidades con grupos carboxilos, ser biodegradables y tener la capacidad de inducir su insolubilización por cambios en el pH del medio. La TRP es una serin-proteasa que cataliza las escisión del enlace peptídico en el extremo C-terminal de los aminoácidos lisina y arginina. Se produce en el páncreas de los vertebrados como zimógeno (tripsinógeno) y luego es activada por una enteroquinasa intestinal en el duodeno donde actúa degradando las proteínas incorporadas en los alimentos para dar péptidos de menor tamaño y aminoácidos para su posterior absorción. Se emplea principalmente en la clarificación de zumos y cerveza, el ablandamiento de cuero y como componente de detergentes enzimáticos. El estudio de la formación de complejos insolubles entre la TRP y cada uno de los PE es importante ya que sienta las bases para el desarrollo de una técnica bioseparativa aplicable al aislamiento de la enzima a partir de páncreas bovino o porcino que resulta ser un desecho de la industria frigorífica local. En las primeras etapas de este trabajo se investigaron las condiciones óptimas para la interacción entre la TRP y cada PE: se obtuvieron los diagramas de fase de cada polielectrolito y complejo insoluble, las isotermas de titulación turbidimétrica y la cinética de formación de cada complejo insoluble. Los resultados se resumen en la tabla I. A partir de estos datos experimentales se estudió la interacción TRP-PE por calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y dispersión de luz dinámica (DLS). Algunos experimentos no pudieron realizarse con el ALG por inconvenientes metodológicos que este polímero presenta. Los experimentos de ITC mostraron que la TRP se une fuertemente con el EL100 y el ES100 en un proceso conducido entrópicamente. Esto indica que los PE interaccionan hidrofóbicamente con la TRP para formar el complejo insoluble. Teniendo en cuenta el efecto inhibitorio de la fuerza iónica sobre la formación del complejo insoluble (también corroborado por ITC) se puede concluir que existe una interacción mixta entre los polímeros Eudragit® y la TRP. Además, los diagramas de fase de cada complejo evidenciaron que la formación de los mismos es dependiente del pH. Por otro lado, los experimentos con ALG demostraron que este PE interacciona electrostáticamente con la enzima, confirmando los datos de turbidimetría. Tanto para los complejos EL100-TRP y ES100-TRP, como para el complejo ALGTRP, los datos experimentales se ajustaron a una función sigmoidea asociada a un modelo de n sitios independientes y equivalentes. Cuando los experimentos de ITC se realizaron a pH 8 se observó que la interacción entre el ALG y la TRP se inhibía totalmente; mientras el EL100 y el ES100 sí interaccionaron con la enzima. Sin embargo, los diagramas de fase de los respectivos complejos no presentaron turbidez a este pH. Esto indicaría que a pH 8 se forma un complejo soluble entre los polímeros Eudragit® y la TRP mediado principalmente por interacciones hidrofóbicas. Los resultados obtenidos por DLS corroboraron todas las observaciones realizadas para los experimentos de ITC a partir de los radios hidrodinámicos calculados para las especies en cada sistema. También se evaluó la estabilidad enzimática por calorimetría diferencial de barrido (DSC), espectroscopía UV-vis, dicroísmo circular (DC) y medidas de actividad catalítica. Los experimentos de espectroscopía UV-vis y DC mostraron que la interacción entre la TRP y cada PE modifican levemente la estructura secundaria y/o terciaria de la enzima . Esta información es muy importante para estudiar de manera simple, rápida y no destructiva la estabilidad de una proteína. Sin embargo, la técnica por excelencia para estudiar estabilidad es la DSC ya que no sólo se aplica en la determinación de parámetros relacionados directamente con la estabilidad térmica de las proteínas (como el Tm) sino que además permite analizar cambios en el mecanismo de desnaturalización de la misma. En ausencia de PE, la TRP presenta su máxima estabilidad a pH 3 mientras que resulta ser menos estable a pH 8. Esto se condice con los importantes cambios estructurales que sufre la enzima al pasar de un pH a otro ya que a pH 3 la enzima se encuentra en una forma inactiva mientras que a pH 8 se observa la máxima actividad catalítica. La presencia del polímero EL100 alteró significativamente la estabilidad térmica de la TRP y su mecanismo de desnaturalización. Cuando el sistema se incubó a pH 5; la estabilidad térmica de la enzima aumentó considerablemente, evidenciado por un aumento del Tm en 10 °C. A pH 8 la TRP también modificó su mecanismo de desnaturalización aunque su estabilidad térmica no se vio afectada por la presencia del PE. Los estudios realizados para el sistema ES100-TRP mostraron que tanto a pH 5 como a pH 8, la presencia del PE estabilizó la estructura proteica contra la desnaturalización térmica; aumentando el Tm en 4 °C y 2 °C, respectivamente. El mecanismo de desnaturalización de la TRP a cada pH también se modifica en presencia de ES100. Otros análisis importantes sobre la estabilidad estructural de la enzima se llevaron a cabo desde el punto de vista de su actividad catalítica; estudiando el efecto de la presencia del PE a distintas concentraciones de polímero y a través del tiempo. Se observó que la actividad enzimática no se modificó en presencia de distintas concentraciones de cada PE. Los experimentos realizados a través del tiempo mostraron que la interacción de la TRP con los Eudragit® aumentó la estabilidad de la enzima, obteniéndose a cada tiempo ensayado mayor actividad enzimática en presencia de los PE que en su ausencia. Por otro lado, el ALG no presentó un efecto estabilizador de la actividad debido a que al pH de formación del complejo insoluble (pH 3,50) la TRP se encuentra en una forma inactiva pero muy estable. Esta información es muy importante ya que resulta indispensable que la enzima no pierda su actividad catalítica al ser purificada si se la quiere utilizar en la industria. Conociendo las condiciones óptimas de interacción TRP-PE y habiendo corroborado que la presencia de los PE no interfiere con la estructura y la actividad de la enzima; se ensayó el método de precipitación en una solución de TRP comercial para determinar el rendimiento de la técnica. Se observó que el ALG es el mejor precipitante de TRP, obteniéndose aproximadamente un 97 % de la enzima en el precipitado. El EL100 logró precipitar el 72 % de la enzima total mientras que el ES100 tan sólo el 41 %. El precipitado ALG-TRP redisuelto se pasó por una columna cromatográfica de interacción hidrofóbica (HIC) con el objetivo de ensayar la separación de la enzima y el PE. Efectivamente, el ALG no eluyó en la misma fracción que la TRP; recuperándose en consecuencia la enzima libre de polímero. Esto puede llegar a ser decisivo en la aplicación de la TRP en la industria alimenticia o farmacéutica, las cuales requieren elevados niveles de pureza en sus productos y/o procesos. Finalmente, se procedió a precipitar TRP a partir de un homogenado de páncreas con EL100 y ALG, los dos PE que dieron los rendimientos más satisfactorios. El EL100 permitió precipitar la enzima aplicando dos protocolos: formación de complejo soluble y posterior insolubilización del EL100; y formación del complejo insoluble EL100-TRP propiamente dicho. El primer protocolo permitió recuperar el 45 % de la enzima total en el homogenado mientras que el segundo permitió recuperar el 82 %. El ALG permitió recuperar casi toda la TRP en el precipitado obteniéndose un rendimiento igual a 98 %. En conclusión, se puede decir que los tres PE son óptimos para la formación de complejos insolubles con la TRP los cuales pueden emplearse en la concentración, estabilización, inmovilización y/o bioseparación de la enzima. Tanto el EL100 como el ES100 estabilizaron la estructura proteica frente a la desnaturalización térmica y a la degradación en el tiempo. Si bien algunos experimentos de estabilidad en presencia de ALG no pudieron realizarse, se observó que no afecta a la actividad catalítica de la enzima. Adicionalmente, el EL100 y el ALG presentaron elevadas capacidades precipitantes lo que los torna excelentes candidatos para purificar e inmovilizar la enzima por precipitación del complejo insoluble.
Acceso Abierto
Análisis de la participación de los mecanismos de regulación de la expresión génica por microARNs (miRs) en modelos de hepatotoxicidad experimental
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-12-18) Lardizábal, María Noelia; Veggi, Luis María
La hepatotoxicidad, el daño al hígado inducido por xenobióticos, involucra una alteración importante de la expresión génica. Los microARNs (miARNs) son moléculas de ARN pequeñas que regulan negativamente la expresión génica a nivel post‐transcripcional, y están involucrados en numerosos procesos fisiológicos y fisio‐patológicos. La técnica de referencia para determinar los niveles de ARNm y miARNs es la PCR Cuantitativa en Tiempo Real (RT‐ qPCR). Sin embargo, para poder obtener resultados confiables, exactos y precisos mediante esta técnica, es indispensable contar con un método de normalización apropiado que corrija las diferencias introducidas entre las muestras durante su manipulación. En la primera etapa de este trabajo de Tesis se establecieron cuatro modelos experimentales de hepatotoxicidad aguda en ratas, mediante la administración de hepatotóxicos tradicionales: acetaminofeno, tetracloruro de carbono, D‐galactosamina y tioacetamida. Estos modelos se caracterizaron mediante la determinación de actividades enzimáticas de marcadores de daño hepático y mediante examinación histológica. Sobre estos modelos se desarrolló una técnica de determinación de la expresión de ARNm y miARNs por Real Time qPCR (RT‐qPCR), que consistió en la identificación de la combinación de genes óptima para la normalización de los resultados. Esto se llevó a cabo mediante el empleo de diferentes software diseñados específicamente para este fin. El miARN‐122 es un miARN altamente abundante y específico de hígado, donde está involucrado en funciones críticas del hepatocito, y está asociado a ciertas enfermedades hepáticas. En la segunda etapa de esta Tesis se estudió la participación del miARN‐122 y sus mecanismos regulatorios en los modelos de hepatotoxicidad establecidos. Para esto, mediante la técnica RT‐qPCR desarrollada en la primera etapa del trabajo y mediante Western blot, se determinó la expresión del miARN‐122 maduro, de su precursor, sus genes blanco, marcadores de proliferación y diferenciación celular, y aquellos reguladores (globales y específicos) que pudieran alterar la expresión del miARN‐122. Como conclusión, se postula que los niveles del miARN‐122 se encuentran bajo un control transcripcional en procesos de hepatotoxicidad, a través de los factores de transcripción C/EBPα y HNF4α, y se propone que los cambios en la red regulatoria del miARN‐122 se encuentran asociados a la respuesta del hígado frente a la lesión causada por las hepatotoxinas, probablemente a través de procesos de proliferación celular para reparar el tejido dañado.
Acceso Abierto
Análisis de las vías Wnt/β-catenina y TGF-β/Smads en líneas de hepatocarcinoma humano : efectos del Interferón-2b
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2013-03-20) Ceballos Mancini, María Paula; Carrillo, María Cristina
La vía Wnt/β-catenina está frecuentemente activada en el hepatocarcinoma celular (HCC). β-catenina activa se acumula en el citosol y en el núcleo, donde promueve la proliferación celular uniéndose a los factores LEF/TCF, entre ellos TCF4. El factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) participa en los procesos de arresto celular y apoptosis y actúa a través de las proteínas Smads. Una forma de interacción entre las vías Wnt/β-catenina y TGF-β1/Smads es mediante la asociación de Smads con el complejo nuclear TCF4/-catenina. Por otra parte, FoxO3a es miembro de la clase O de factores de transcripción forkhead box y está implicado en procesos tales como arresto celular y apoptosis. FoxO3a interactúa en el núcleo con β-catenina y con Smads para modular la transcripción génica. La señalización de FoxO3a es regulada negativamente por las quinasas Akt, IKKβ y Erk y positivamente por las quinasas JNK y p38. El interferón alfa (IFN-α) presenta propiedades antiproliferativas y proapoptóticas y se sugiere una potencial eficacia de la terapia con esta citoquina para el tratamiento del HCC. En este trabajo de tesis analizamos los efectos de IFN-2b y de TGF-β1 sobre la proliferación celular y la apoptosis y sobre la vía Wnt/β-catenina, los intermediarios Smads, el factor FoxO3a y su modulación por quinasas y la interacción entre estas señales, en las líneas de HCC HepG2/C3A y Huh7. La respuesta global de las células a los tratamientos con IFN-2b y con TGF-β1 fue la disminución de la proliferación y el incremento de la apoptosis. IFN-2b y TGF-β1 atenuaron la vía Wnt/β-catenina disminuyendo los niveles proteicos de β-catenina y del receptor de la vía Frizzled7 y la interacción entre β-catenina y TCF4. Los niveles de la forma truncada de β-catenina presente en HepG2/C3A también se redujeron luego de los tratamientos. Ambas citoquinas disminuyeron el contenido de las proteínas Smads y su asociación con TCF4. En conjunto, estos resultados indicarían la reducción de la formación de complejos Smads/TCF4/β-catenina en presencia de IFN-2b y de TGF-β1. El tratamiento con Wnt3a, que actúa como ligando de la vía Wnt/β-catenina, elevó los niveles de la proteína β-catenina y de los intermediarios Smads, indicando que la activación de vía Wnt/-catenina genera el incremento de los niveles proteicos de Smads. Por otro lado, el tratamiento con IFN-2b disminuyó los niveles proteicos de las formas activas de Akt, IKKβ y Erk e incrementó los niveles de las formas activas de JNK y p38. Adicionalmente, IFN-2b elevó los niveles nucleares de FoxO3a y este proceso estuvo mediado por la modulación de Akt, IKKβ, Erk y p38 por la citoquina. Al mismo tiempo, la estimulación de las células con IFN-2b incrementó la asociación de FoxO3a con -catenina y con Smads, lo cual implicaría un desplazamiento de - catenina y de Smads desde TCF4 hacia FoxO3a. Esto disminuiría la actividad transcripcional de TCF4 contribuyendo a la atenuación de la vía Wnt/-catenina causada por IFN-α2b y, además, aumentaría la actividad del factor de transcripción FoxO3a. En conclusión, las citoquinas IFN-2b y TGF-β1 mostraron ser efectivas como moduladores de la vía Wnt/β-catenina en líneas de HCC tanto en presencia de β-catenina salvaje como de su forma truncada. Adicionalmente, el desacoplamiento de los complejos Smads/TCF4/β-catenina contribuiría a contrarrestar la hepatocarcinogénesis, ya que la acción global de las citoquinas fue disminuir la proliferación celular y aumentar la apoptosis. El aumento nuclear de FoxO3a, su asociación con Smads y con β-catenina y la regulación de Akt, IKKβ, Erk, JNK y p38 mediada por IFN-2b, colaborarían en estos eventos. Así, estos hallazgos tendrían relevancia en el futuro diseño de estrategias terapéuticas para pacientes con HCC que dirijan las respuestas celulares hacia la supresión tumoral.
Acceso Abierto
Análisis de variabilidad y selección de entradas de buen desempeño en un germoplasma de durazneros y nectarinos [Prunus persica (L) Batsch]
(2016) Maulión, Evangelina; Cervigni, Gerardo Domingo Lucio; Valentini, Gabriel Hugo
El duraznero (Prunus persica (L.) Bastch) es uno de los frutales más difundidos en todo el mundo, siendo Argentina el noveno país productor del mundo. Las variedades comercializadas en nuestro país proceden en su mayoría de programas de mejora estadounidenses y fueron adaptadas a condiciones locales de cultivo. No obstante, se ha potenciado el desarrollo de programas nacionales para la búsqueda de nuevos cultivares, con buena calidad de fruto y adaptados a las condiciones de cultivo regional. En este marco, la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) San Pedro lleva a cabo una intensa labor en la evaluación y selección de variedades en función de aspectos relacionados a la adaptación a las condiciones locales de cultivo y ha puesto en marcha un programa que consiste en realizar cruzamientos para incrementar y mejorar la productividad de los montes en la zona. Por lo expuesto, en este trabajo se evaluó el comportamiento agronómico de la colección de durazneros y nectarinos de la EEA INTA San Pedro durante 8 años y se seleccionaron cultivares de buen desempeño. La comprensión de la fenología del duraznero permite mejorar las técnicas de cultivo y seleccionar materiales cuyas yemas florales presenten requerimientos térmicos en concordancia con el régimen de temperatura del monte frutal para obtener una producción exitosa. Por estos motivos, en primera instancia se estimaron los requerimientos de frío y de calor de las yemas florales para salir del letargo fisiológico. El modelo propuesto por Luedeling permitió realizar las estimaciones correctamente en las condiciones de campo estudiadas, siendo recomendable el cálculo del frío acumulado según los modelos Horas de Frío y Utah Positivo. Además, el efecto de los requerimientos de frío sería más importante que el efecto de los requerimientos de calor para regular la floración de los genotipos evaluados y, en consecuencia, las entradas con bajos requerimientos de frío florecerían antes que aquellas con altos valores del mismo. En lo que respecta a los estudios de adaptabilidad y estabilidad, la identificación de genotipos con rendimientos aceptables y estables en diversos ambientes es de gran importancia en materia de mejoramiento vegetal. La interacción genotipo ambiente de tipo compleja fue la de mayor importancia, indicando que la selección de genotipos de alto rendimiento y estabilidad sería una tarea laboriosa para los mejoradores. Dentro de las variables ambientales estudiadas, se detectó que la interacción entre la lluvia y la acumulación del calor durante el período de desarrollo del fruto explicó el 96,7% de la variación interanual del rendimiento. Se aplicaron diversas metodologías estadísticas a matrices de datos balanceadas y desbalanceadas, y los índices I, P, RS y GSI; el parámetro S(1) combinado con el rendimiento medio; y los métodos RY y DGC resultaron útiles para seleccionar genotipos estables y rendidores. Dentro de los materiales evaluados, los durazneros Flavorcrest, Flameprince y Fireprince y los nectarinos Vega y DOFI-86.395.095 fueron los más estables y rendidores. Finalmente, se evaluaron características agronómicas y parámetros de calidad de fruto demostrando el gran potencial que presentan las técnicas multivariadas para analizar el perfil fenotípico de la colección y se han expuesto asociaciones entre caracteres que deberían ser consideradas si se desea obtener nuevos materiales mediante cruzamientos de genotipos evaluados. Se reveló una gran capacidad de discriminación por parte de todas las variables medidas, a excepción de los caracteres tamaño del carozo respecto al fruto y peso del fruto, lo cual indicaría que éstos tienen una baja contribución a la variabilidad general y no serían importantes en la identificación y descripción de las entradas en estudio. Se encontraron asociaciones entre los caracteres adherencia de la pulpa al carozo, pigmentación antociánica de la pulpa alrededor del carozo y coloración del mismo. Por el contrario, los caracteres fenológicos, la productividad y la calidad del fruto y época de cosecha no estarían relacionados entre sí. Adicionalmente, se realizó un Análisis de Conglomerados que permitió agrupar las entradas según su potencial uso en programas de mejora. La amplia variabilidad fenotípica que presenta el germoplasma disponible en la EEA INTA San Pedro y el estudio realizado en la presente tesis constituye una herramienta de gran utilidad para futuros programas de mejora y selección de cultivares de buen desempeño. Asimismo, este trabajo ha permitido la preselección de 7 genotipos - los nectarinos DOFI-86.395.095, María Aurelia y Vega, y los durazneros Fireprince, Flameprince, Flavorcrest y Sunprince - con la mejor combinación de atributos agronómicos, de calidad del fruto y estabilidad en las condiciones estudiadas.
Acceso Abierto
Análisis Farmacoterapéutico de un paciente diabético con shock séptico
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2018) Yonzo, Claudia Elizabeth; Torres, Adriana Mónica
El seguimiento farmacoterapéutico es una actividad que puede desarrollarse tanto en el ámbito hospitalario como comunitario. El presente trabajo consiste en un análisis farmacoterapéutico de un paciente adulto diabético que ingresa al hospital para una cirugía para la colocación de un tutor externo debido a la fractura del fémur izquierdo y al que se le diagnostica shock séptico. Sin intervenciones profesionales farmacéuticas reales, se analizan las prescripciones y la evolución de su situación de salud mientras dura la internación, basados fundamentalmente en la documentación emanada de la Historia Clínica. Se destacan los problemas relacionados con medicamentos (PRM) y se realizan recomendaciones farmacéuticas que podrían servir como guía básica para la recuperación.
Embargo
Análisis funcional comparativo de las ferredoxinas-NADP+ reductasas de patógenos bacterianos
(2022) Monchietti, Paula; Catalano Dupuy, Daniela L.; Ceccarelli, Eduardo Augusto
Los procesos redox son esenciales para el mantenimiento de la vida. Estas reacciones, llevadas a cabo fundamentalmente por oxidoreductasas, poseen relevancia en todos los organismos. Dentro del grupo de las oxidoreductasas, las flavoenzimas cumplen un rol preponderante por su capacidad de transferir electrones entre sustratos mono y bielectrónicos. Las Ferredoxinas-NADP+ reductasas (FNR) constituyen una familia de proteínas hidrofílicas monoméricas que contienen FAD no covalentemente unido como grupo prostético. Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas entre los organismos vivos y están involucradas en la transferencia electrónica en diversos procesos biológicos importantes. Las FNR se clasifican en dos tipos: planta y mitocondrial. A su vez, las FNR tipo planta son agrupadas en las clases plastídica y bacteriana. En organismos fotosintéticos, la FNR es la limitante de la producción de NADPH y, por consiguiente, del proceso de fotosíntesis global. En cambio, las FNR presentes en tejidos y organismos heterotróficos operan en la dirección contraria, conduciendo los equivalentes de reducción desde el “pool” de NADPH celular hacia los transportadores electrónicos de bajo potencial (Fd, Fld, adrenodoxina) para diversos metabolismos de óxido-reducción. Las FNR bacterianas participan en vías metabólicas especialmente apropiadas para el desarrollo de agentes antimicrobianos ya que no se encuentran presentes en humanos. Por esto, pueden ser un blanco importante para el diseño de inhibidores en la lucha contra enfermedades causadas por diferentes patógenos. El modelo más aceptado para el mecanismo catalítico de las FNR es el que ha sido propuesto para las enzimas plastídicas, las cuales poseen un residuo tirosina en su carboxilo terminal, absolutamente conservado, que se encuentra interaccionando con la isoaloxacina del FAD. Esta tirosina sería desplazada para permitir la entrada del sustrato NADP+ durante la catálisis. Por otra parte, las FNR plastídicas presentan números de recambio entre 20 y 100 veces mayores a los de las FNR bacterianas, lo que sugiere que éstas últimas presentan limitaciones catalíticas, las cuales fueron superadas por la contraparte funcional presente en organismos y tejidos fotosintéticos. Sin embargo, las bases bioquímicas de estas ventajas catalíticas aún no han sido elucidadas. Además, las FNR bacterianas presentan una región carboxilo terminal estructurada y variable, que no ha permitido proponer modelos lógicos que justifiquen cómo el sustrato logra alcanzar el sitio activo. Evidencias preliminares nos indican que en las enzimas bacterianas el mecanismo catalítico sería diferente. En el laboratorio previamente se habían obtenido cristales de una FNR mutante de E. coli (EcFPR) observándose que contenía el sustrato NADP+ firmemente unido, a pesar de que el mismo no había sido adicionado en el proceso de cristalización. La estructura tridimensional mostró que el NADP+ interacciona con tres argininas. Estos residuos podrían ser los responsables de generar un sitio altamente estructurado con alta afinidad por el nucleótido. Estos tres aminoácidos estarían conservados en las enzimas bacterianas, pero no en las enzimas plastídicas de alta eficiencia catalítica, presentes en cloroplastos de plantas y en cianobacterias. En este trabajo de Tesis, realizamos un estudio funcional comparativo entre FNR plastídicas y bacterianas. Demostramos que las FNR bacterianas purificadas contienen el sustrato NADP+ fuertemente unido. El nucleótido permanece unido a la enzima luego de una extensa diálisis y filtración en gel. Por el contrario, las FNR plastídicas analizadas no lo contienen. El NADP+ podría ejercer una regulación enzimática ya que observamos una correlación entre las cantidades de nucleótido unido a las FNR y las velocidades catalíticas. La presencia de NADP+ redujo considerablemente la actividad de EcFPR, que se recuperó cuando se eliminó el nucleótido de la enzima. Vimos también que la unión del NADP+ produjo una estabilización de la estructura en las FNR bacterianas, pero no se observó ningún efecto sobre las contrapartes plastídicas. Para investigar más a fondo la participación de las argininas mencionadas anteriormente en la unión del NADP+ , construimos diferentes enzimas mutantes de EcFPR y de la FNR plastídica de Pisum sativum (PeaFNR). La caracterización cinética, estructural y de estabilidad de estas proteínas nos permitió confirmar que los residuos R144 y R184 en EcFPR están involucrados en la generación de un sitio estructurado con muy alta afinidad por el NADP+ Nuestros resultados sugieren que las FNR bacterianas muestran un modo de unión de NADP+ diferencial y, por consiguiente, un mecanismo catalítico diferente al propuesto para las FNR tipo plastídicas. Estos hallazgos son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta Tesis y nos permitieron plantear por primera vez un modelo de unión y catálisis del NADP+ para las FNR bacterianas. Proponemos que esta fuerte unión constituye un mecanismo catalítico y regulador esencial de estas enzimas, involucradas en la homeostasis redox de la célula.
Acceso Abierto
Análisis funcional del complejo MutSγ de Arabidopsis thaliana
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2012-10-19) Gómez, Rodrigo Lionel; Spampinato, Claudia P.
El sistema MMR, constituye uno de los pilares fundamentales del mantenimiento de la estabilidad génica de todos los organismos. Su funcionalidad está altamente relacionada a los pasos post replicativos, sin embargo, han sido propuestos roles adicionales del sistema entre los que se encuentra la corrección de lesiones oxidativas sobre el ADN. El sistema MMR se encuentra conservado desde organismos procariotas a eucariotas, presentando mayor complejidad en estos últimos. El paradigma bacteriano se estableció en primer lugar en E. coli donde existen tres homodímeros específicos del sistema denominados MutS, MutL y MutH. En eucariotas, se ha demostrado la existencia de parálogos de MutS (denominados MSHs) y de MutL (denominados MLH y PMS) que forman heterodímeros funcionales específicos. Sin embargo, no existen homólogos eucariotas de MutH. El primer paso del sistema involucra el reconocimiento de lesiones en el ADN, principalmente apareamientos incorrectos o desapareamientos de bases, por complejos del tipo MutS. En eucariotas existen dos heterodímeros conservados que difieren en su especificidad de reconocimiento de lesiones. El primero se denomina MutSα y está formado por las subunidades MSH2 y MSH6, mientras el segundo se denomina MutSβ y se encuentra conformado por las subunidades MSH2 y MSH3. En A. thaliana y otras plantas estudiadas existe un tercer parálogo de MutS denominado MSH7. Esta subunidad forma junto con MSH2 el complejo heterodimérico MutSγ. Existen numerosos estudios sobre el sistema MMR en bacterias, células humanas y levaduras, sin embargo, el conocimiento del mismo en plantas es aún escaso. Ante este escenario se planteó como uno de los objetivos del presente trabajo extender el conocimiento sobre el sistema MMR de plantas, principalmente centrándose en el rol del complejo MutSγ, exclusivo de estos organismos. Adicionalmente, se estudió la relación del sistema MMR con la reparación del daño oxidativo en el ADN. En primer lugar, se expresó la subunidad AtMSH2 en un sistema bacteriano y se purificó a homogeneidad con la finalidad de utilizar esta proteína en futuros ensayos bioquímicos in vitro. Adicionalmente, se utilizaron anticuerpos generados contra esta subunidad para demostrar la existencia de un ortólogo de MSH2 en inflorescencias de Brassica olaracea, especie relacionada filogenéticamente con A. thaliana. La presencia de la proteína en inflorescencias sería importante para mantener la fidelidad genética durante la siguiente generación. De hecho, también se observó que los niveles transcripcionales del gen MSH2 en A. thaliana son 70 veces superior en callos con respecto a los valores de plántulas, asociado probablemente a la mayor tasa de replicación existente en estos tejidos. Los niveles de expresión de los genes MSH2, MSH6, MLH1 y PMS1, también, se evaluaron en plantas salvajes sometidas a condiciones de estrés oxidativo, por tratamiento con MV y estrés salino, por tratamiento con NaCl. En general, todos los genes mostraron un aumento en su expresión en relación a las condiciones control, sin embargo, los incrementos dependieron del gen en estudio y del tratamiento. AtPMS1 fue el único gen que mostró una disminución en su expresión relativa cuando se estudió el efecto de NaCl. Estos experimentos se extendieron a estudiar el efecto del estrés oxidativo y salino en plantas de A. thaliana salvajes o mutantes en el gen MSH2. Se observaron disminuciones de las cantidades de clorofilas a y b y en la elongación de raíces, tanto en plantas salvajes (control) como en plantas mutantes sometidas a tratamientos de estrés. Adicionalmente, se observó una mayor acumulación de bases oxidadas, 8-oxoG, en el ADN de plantas sometidas a estrés oxidativo, sin evidenciarse diferencias atribuibles a los genotipos. En conjunto, estos datos no permiten establecer una relación directa entre el sistema MMR y la reparación del daño oxidativo en el ADN. Finalmente, se caracterizó la función de AtMutSγ en un sistema in vivo. Para ello, se expresaron las subunidades AtMSH2 y AtMSH7 en un huésped heterólogo. La expresión funcional del complejo se confirmó mediante ensayos de cambios de movilidad electroforética y medidas de tasas de mutaciones de distintos marcadores moleculares. A partir de la comparación de las tasas de mutaciones, se determinó que la expresión de AtMutSγ produce un aumento en la frecuencia de mutaciones del tipo de sustitución de bases en el ADN, evidenciada por uno de los genes reporteros utilizados (CAN1). El análisis del espectro mutacional de CAN1 permitió confirmar que el aumento en la tasa de mutaciones se debe a sustituciones de bases. Adicionalmente, los resultados obtenidos permitieron inferir cierta especificidad de reconocimiento de AtMutSγ, mediante la prevalencia de ciertas sustituciones sobre las demás. Estas sustituciones involucran los cambios de T por A, C o G y de G por A en la hebra codificante del CAN1. De esta forma, AtMutSγ reconocería preferencialmente los apareamientos incorrectos que causan estas mutaciones. Estos datos, abren nuevas perspectivas para continuar avanzando en la elucidación de las bases moleculares y bioquímicas de este sistema de reparación en plantas.
Acceso Abierto
Anemia en la Insuficiencia Renal
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-04-10) Nardelli, Javier Anibal; Acosta, Irma del Luján
Conclusión: El conocimiento y manejo de la anemia en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) se ha convertido en un pilar del tratamiento de la enfermedad renal; el reconocimiento de los beneficios que su control brinda en la sobrevida y en la calidad de vida de los pacientes, así como los cambios en su terapéutica durante los últimos años centrados en su óptima corrección, motivan la actualización permanente. El parénquima renal representa en la especie humana el 1% de la masa corporal total, recibe aproximadamente un 20% del gasto cardíaco y consume casi el 8% del oxígeno utilizado en reposo, lo que da una idea de su potencial metabólico, participando en múltiples procesos para mantener el equilibrio interno. Uno de ellos es la síntesis de eritropoyetina por parte de las células peritubulares intersticiales. Dicha hormona actúa induciendo la diferenciación y maduración de precursores de la serie roja en la médula ósea. Por ello no es extraño que la insuficiencia renal se acompañe más o menos tempranamente de anemia. Aún cuando la causa primaria de la anemia durante la progresión de la enfermedad renal crónica es el fracaso de la función endócrina del riñón, a través del déficit de eritropoyetina endógena por menor masa renal funcionante, contribuye en gran medida el déficit de hierro; considerando tanto un “déficit absoluto” caracterizado por la reducción de la absorción gastrointestinal de hierro, depleción de las reservas corporales de hierro debido principalmente a una nutrición inadecuada, pérdida crónica de sangre, ( frecuentes extracciones de sangre para estudios de laboratorio, sangrado gastrointestinal oculto , pérdidas asociadas al procedimiento de diálisis, etc.) y un “déficit funcional”que se caracteriza por un depósito de hierro normal e inadecuada disponibilidad del mismo para satisfacer las demandas de la eritropoyesis. Este disturbio puede verse asociado a procesos inflamatorios, por acción de citoquinas que aumentan la captación de hierro por los macrófagos del sistema reticuloendotelial disminuyendo su disponibilidad. Medidas terapéuticas como la diálisis o la medicación generan efectos secundarios adversos indeseados al hematíe, contribuyendo al cuadro anémico del paciente con IRC. Estas alteraciones, tanto químicas, mecánicas o térmicas, como deshidratación, recalentamiento o acumulación de cationes metálicos como el Al, potenciadas por el stress energético, oxidativo y osmótico al que están sometidos en los organismos urémicos llevan a modificaciones tanto en estructuras de membrana como citoplasmáticas. Contribuyentes de estos efectos son las toxinas urémicas de retención, generadoras de daño celular con numerosos puntos de acción, desde estructuras propias de los eritrocitos, como así también del entorno en el que se encuentre, como médula ósea o la pared de los vasos por los que circulan. El desequilibrio hormonal, como ocurre con la PTH, afecta directamente a la formación de eritrocitos a nivel medular, como así también de manera indirecta, modificando la composición hidroelectrolítica del medio que los rodea o generando mielofibrosis y obliterando la médula ósea. En los últimos años, el tratamiento de la anemia en esta patología ha mejorado sustancialmente debido al uso regular de agentes estimuladores de eritropoyesis y suplementos de hierro y sin restar importancia, la modificación de los hábitos dietarios. Entre los beneficios de un tratamiento adecuado de la anemia destacan una mejoría en la calidad de vida de los pacientes, efectos cardiovasculares y mejoría de la capacidad funcional y cognitiva y disminución del número de transfusiones de glóbulos rojos. En pediatría se ha comprobado igualmente la disminución del efecto de retraso del crecimiento que presentan estos pacientes. El estricto control de la ferroterapia es muy importante. Ajustar la posología del hierro administado requiere la monitorización de recuento eritrocitario, hemoglobina, índices hematimétricos, ferremia, transferrina y porcentaje de saturación y ferritina en función de la respuesta eritropoyética. La administración de hierro, y en particular, su sobredosificación se ha asociado a manifestaciones de sobresaturación, shock y sepsis, así como su depósito en tejido cardíaco, hepático, pancreático o muscular; además de causar cefalalgia, algias musculares y otras expresiones mórbidas menores. Desde la introducción de la eritropoyetina recombinante humana, los agentes estimuladores de la eritropoyesis se han convertido en la piedra angular del tratamiento de la anemia de la enfermedad renal crónica. Frente a esta nueva conducta de tratamiento, cabe una mención especial y no menos importante a la resistencia o respuesta inadecuada a determinados AEE, como así también los casos de eritroblastopenia asociada con la aparición de anticuerpos dirigidos contra ciertas formas bioequivalentes a la eritropoyetina.
Embargo
Anticoagulantes orales directos
(2022) Núñez, María Candela; Pratti, Arianna Flavia
La hemostasia es un conjunto de mecanismos fisiológicos que mantienen la fluidez de la sangre y la integridad de la pared vascular. La coagulación sanguínea es un sistema delicadamente equilibrado: la sangre se mantiene en un estado fluido en la vasculatura, pero coagula rápidamente para sellar una lesión. Cuando fallan las funciones hemostáticas, se producen hemorragias o fenómenos trombóticos. La trombosis es responsable de distintas afecciones que pueden llevar a la muerte. Una de cada 4 personas en el mundo muere por patologías causadas por trombosis. Los pacientes que han tenido un primer evento trombótico, necesitan tratamiento médico para reducir el riesgo de recurrencia. La terapia de anticoagulación es una piedra angular para la prevención y tratamiento de estas afecciones. Los nuevos anticoagulantes orales directos reflejan un cambio de paradigma en la prevención del accidente cerebrovascular. Numerosos estudios de investigaciones clínicas han demostrado la eficacia del Dabigatrán Etexilato, Rivaroxabán y Apixabán, y avalan su uso para la profilaxis y tratamiento de la mayoría de los pacientes con tromboembolismo venoso (TEV). Estos DOACS no requieren monitoreo mediante determinaciones de laboratorio, pero en determinadas circunstancias es necesaria la medición de los niveles de fármaco en sangre. Se encuentran disponibles ensayos, de rutina y especializados, para su evaluación y cuantificación.
Acceso Abierto
Aplicación de reacciones en paralelo para la obtención de extractos modificados
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2018-10-01) Santa Cruz, Pablo Emilio; Escalante, Andrea Marta; Furán, Ricardo Luis Eugenio
El acceso a bibliotecas de compuestos con propiedades biomoleculares interesantes es una etapa limitante en el proceso de descubrimiento de drogas. Los productos naturales (PNs) han sido muy valiosos como plataformas validadas biológicamente por contener esqueletos moleculares que presentan dichas cualidades. En una serie de artículos de revisión, Newman, Craig y colegas, han analizado las fuentes de drogas demostrando la valiosa y continua contribución de las plataformas naturales como fuente de compuestos líderes que han servido de inspiración para la síntesis de nuevas drogas. De los nuevos medicamentos aprobados por la Administración de Medicamentos y Alimentos de Estados Unidos (FDA, del inglés Food and Drug Administration) entre 1981-2010, el 34 % estaban basados en moléculas pequeñas de PNs o derivados directos de los mismos, incluyendo las estatinas, diferentes medicamentos contra el cáncer y algunos inmunosupresores. La preparación de extractos modificados (EMs) a través de diversificación química dirigida representa una forma alternativa e interesante de usar esqueletos naturales conocidos y desconocidos como material de partida para la generación de bibliotecas semisintéticas de compuestos con propiedades biológicas de interés. La clave para lograr la alteración de una proporción significativa de los componentes de una mezcla compleja yace en la selección de potenciales grupos reactivos que puedan ser encontrados en la mayoría de las pequeñas moléculas presentes en PNs e introducir nuevas funcionalidades potencialmente activas en propiedades de reconocimiento molecular. La hipótesis postulada en mi trabajo de tesis plantea la utilización de secuencias de reacciones dirigidas a transformar grupos funcionales de alta presencia en compuestos de plantas medicinales lo cual permitiría incorporar nuevos fragmentos relevantes como farmacóforos y diversificar las propiedades biomoleculares de sus componentes. Las modificaciones químicas en PNs están dirigidas al desarrollo de funcionalidades atípicamente encontradas en derivados de origen natural a través de reacciones destinadas a transformar grupos funcionales (GF) de alta presencia en PNs tales como dobles enlaces, anillos aromáticos, carbonilos, aminas y alcoholes. La incorporación de átomos de halógeno es una estrategia común para modificar moléculas con el objeto de alterar sus bioactividades y especificidades. Diferentes estudios demuestran que la proporción de halógenos en drogas es significativamente mayor que en productos naturales. Dentro de los metabolitos secundarios halogenados, aquellos que contienen bromo se encuentran en el segundo lugar en abundancia, luego de los clorados. Estos metabolitos son mayoritariamente producidos por organismos marinos (algas, esponjas, corales, moluscos, etc.), a partir de los cuales se han aislado varios metabolitos con actividad antibacteriana, antitumoral, antiviral y antifúngica. En contraste, las plantas terrestres raramente contienen compuestos bromados por lo que consideramos interesante realizar la bromación de esqueletos naturales presentes en extractos de plantas no marinas y analizar el efecto de este proceso sobre las propiedades biomoleculares de las mezclas. El contenido de azufre de los productos naturales extraídos de plantas es inferior al contenido observado en otras de fuentes de origen natural. De los 6.629 compuestos de origen vegetal reportados en la Base de Datos de Productos Naturales Bioactivos (BDPNB), sólo un 2,1 % incorporan azufre en sus estructuras. Los GF azufrados presentes en productos naturales son variados. Entre ellos se encuentran tioles, sulfuros, disulfuros, tiosulfonatos, tiosulfinatos, sulfóxidos, sulfonas, isotiocianatos, polisulfuros, ácidos sulfínicos y sulfénicos. La baja cantidad de compuestos azufrados encontrados en plantas, la relativamente baja diversidad de GF encontrados dentro de ellos y las importantes actividades biológicas que muestran, hacen interesante la introducción de este elemento en productos naturales de origen vegetal. Si bien los grupos nitrogenados se encuentran presentes en una buena cantidad de productos naturales, su abundancia es inferior a la observada en poblaciones de moléculas empleadas como drogas. Dentro de los grupos nitrogenados presentes en productos naturales, aquellos que contienen dos átomos de nitrógeno adyacentes representan una porción minoritaria. Específicamente, las moléculas que contienen hidracinas, hidrazidas o hidrazonas sólo representan, de acuerdo a un análisis estadístico, el 0,7% del total de metabolitos secundarios. Todo esto convierte al grupo N-N en un fragmento interesante a ser introducido en esqueletos de productos naturales. La modificación de grupos C=O, presentes en más del 70% de los PNs, ofrece el acceso óptimo para la incorporación de N a través del empleo de hidracina. La alta diversidad química de las moléculas presentes en extractos de PNs vegetales y el hecho de desconocer las composiciones químicas de estas mezclas sumado al cambio estructural que se produce al modificarlas, hace que el análisis de los extractos de partida y modificados resulte un desafío. Por este motivo, tanto el seguimiento de las reacciones como el monitoreo de su efecto sobre las propiedades de las mezclas se efectúa por comparación de sus (1) perfiles químicos y (2) perfiles de bioactividad. 1) Los perfiles químicos tienen como objeto intentar estimar el éxito de la reacción y su impacto en la composición. Con “éxito de la reacción” nos referimos a observar cambios en propiedades relacionadas a los GF de alta presencia o a GF que se desean introducir en la mezcla. Con “impacto en la composición” nos referimos al grado en que la composición química es alterada por la reacción. Dentro de las técnicas analíticas útiles para establecer perfiles y analizar la composición de mezclas complejas como son los extractos vegetales, pueden considerarse a las cromatográficas, espectrométricas y a sus combinaciones como las más relevantes. Dentro de las técnicas cromatográficas, la cromatografía líquida asociada a espectrometría de masa (CL-EM) es una técnica muy usada para el análisis de mezclas complejas de origen natural que se ha impuesto como una combinación robusta que permite la identificación de cientos de metabolitos en mezcla. El acoplamiento de técnicas de separación cromatográfica como CL a analizadores de masa permite una correcta deconvolución de los picos de mezclas complejas debido a la alta velocidad de escaneo que presentan estos instrumentos. El impacto en la composición de los extractos fue estudiado utilizando CL-EM además de cromatografía en capa delgada (CCD) aplicando diferentes reveladores, entre ellos 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH). 2) La comparación de perfiles de bioactividad entre extractos de partida y EMs se realizó a través de ensayos autográficos. Dado que los métodos autográficos combinan la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada con la determinación in situ de la actividad biológica de los componentes de una mezcla, en conjunto permiten pre-asignar de manera cualitativa bioactividad sobre uno o más componentes de la misma. Se utilizaron ensayos autográficos previamente desarrollados y descriptos por nuestro grupo para detectar inhibidores de acetilcolinesterasa, xantina oxidasa, β-glucosidasa y tirosinasa. Además, con el objeto de analizar el efecto de la modificación química frente a nuevas propiedades biomoleculares, se aplicó el ensayo que permite detectar inhibidores del Bromodominio Funcional 3 de Trypanosoma cruzi (TcBDF3), el cual juega un papel muy importante como potencial blanco terapéutico contra la enfermedad de Chagas. Este último estudio se hizo en colaboración con el grupo del Dr. Esteban Serra. En principio se prepararon extractos provenientes de plantas medicinales (Cynara scolymus, Peumus boldus, Arctium lappa y Silybum marianum) utilizando dos metodologías: extracción por calentamiento a reflujo y maceración. Los dos tipos de extracciones se realizaron con el fin de observar si se producía alguna diferencia en la composición química de los extractos obtenidos a partir de la aplicación de cada una de las mencionadas técnicas extractivas. En particular, sobre el material utilizado de la especie S. marianum se aplicó previamente extracción por Soxhlet utilizando hexano como solvente, debido a que la droga vegetal posee un alto contenido de grasas. Una vez preparados todos los extractos, se analizaron cualitativamente sus composiciones químicas. Para ello, se utilizaron CCD y CL-EM. Los extractos de C. scolymus y S. marianum obtenidos por maceración y por reflujo mostraron perfiles cromatográficos diferentes, por lo cual todos los extractos provenientes de estas dos especies fueron seleccionados para modificación química. En cambio, los de A. lappa y P. boldus obtenidos por maceración y calentamiento a reflujo mostraron perfiles cromatográficos muy similares y por ello sólo los extractos macerados fueron seleccionados para su posterior modificación química. En paralelo, se modificaron 7 extractos nativos (de C. scolymus obtenidos por maceración y calentamiento a reflujo; de S. marianum obtenidos por Sohxlet, maceración y calentamiento a reflujo; de P. boldus y A. lappa obtenidos por maceración), aplicando reacciones de bromación, sulfonilación o hidracinólisis, utilizando como reactivos bromo, cloruro de p-toluen sulfonilo o hidracina monohidrato (N2H4.H2O), respectivamente. Se obtuvieron en total 42 extractos modificados a partir de los 7 extractos de partida. El éxito de las reacciones de modificación se estudió utilizando CCD y CL-EM, a través de cambios detectados en extractos modificados vs. extractos de partida. El impacto de la modificación química sobre la composición de los extractos fue evaluado inicialmente por CCD utilizando diversos reveladores. Interesantemente, tras la reacción de hidracinólisis, se observó la presencia de nuevos compuestos captadores de radicales DPPH en el cromatograma de los extractos modificados de A. lappa, P. boldus, C. scolymus y S. marianum. Este resultado nos llevó a sugerir que la reacción de modificación con hidracina daba lugar a la formación de nuevos compuestos los cuales podrían contener en su estructura porciones provenientes de N2H4.H2O. Por otro lado, el efecto de la modificación química de los extractos sobre las propiedades biomoleculares fue evaluado por medio de cuatro ensayos bioautográficos que permiten detectar inhibidores de las enzimas β-glucosidasa, acetilcolinesterasa, xantina oxidasa y tirosinasa. La falta de actividad inhibitoria de todas las mezclas (naturales y semisintéticas) frente a las tres primeras enzimas nos permitió concluir que para este grupo de extractos sus propiedades biomoleculares no cambian tras las reacciones aplicadas o bien los cambios no son detectables bajo las condiciones experimentales empleadas. Sin embargo, los resultados frente a tirosinasa mostraron cambios de bioactividad en los extractos de C. scolymus modificados con N2H4.H2O, no resultando así para el conjunto los demás extractos. La comparación de perfiles de CL-EM de los extractos de C. scolymus, de partida y modificados con N2H4.H2O, permitió visualizar cambios significativos en la composición. Uno de los cambios definidos fue la desaparición del pico correspondiente a un compuesto en particular, ácido clorogénico, presente en el extracto de partida y ausente en el extracto modificado de C. scolymus. Dada la actividad frente a tirosinasa hallada en los extractos de esta especie modificados con N2H4.H2O, planteamos como probabilidad que la misma podría surgir de la generación de compuestos provenientes de la modificación del ácido clorogénico (mono-cafeoilquínico) con N2H4.H2O. Este metabolito se encuentra descripto en la droga vegetal de la especie y puro resultó inactivo frente a tirosinasa al igual que los extractos de partida de C. scolymus. La purificación por cromatografía en columna (CC) del extracto modificado y el posterior análisis de los espectros de RMN y EM de las fracciones purificadas activas, permitieron detectar la presencia de una tentativa pirazolidinona producto de la reacción entre el ácido clorogénico e N2H4.H2O. Se modificó químicamente ácido clorogénico puro con N2H4.H2O siguiendo las mismas condiciones de reacción aplicadas en los extractos, las cuales fueron luego optimizadas. La optimización muestra que la cantidad de N2H4.H2O utilizada durante la reacción de modificación es clave para la generación de los productos modificados que resultan activos frente a tirosinasa. Paralelamente, se modificó cafeoato de metilo (contiene la porción cafeoil presente en el ácido clorogénico) con N2H4.H2O y el producto obtenido mostró el mismo perfil de actividad tirosinasa que el encontrado para los productos del clorogénico modificado con N2H4.H2O. Con experimentos de CLAE-EM se detectaron masas coincidentes con las correspondientes a cafeoilpirazolidinona y cafeoilhidrazida potencialmente resultantes de la hidracinólisis del cafeoato de metilo. Se escaló la reacción de modificación de cafeoato de metilo con N2H4.H2O y se obtuvo una mezcla de compuestos activos que al intentar ser purificada y sus fracciones caracterizadas por RMN y CLAE-EM, nuevamente mostraron la posible pirazolidinona y la acilhidrazida anteriormente mencionadas en mezcla. Se planificaron y realizaron sucesivas purificaciones mediante CC en fase normal y también por CLAE preparativo en fase reversa con previa optimización del método por CLAE analítico. Aun así, no se lograron separar totalmente los compuestos propuestos. A partir de los resultados alcanzados se plantearon posibles mecanismos de reacción de la porción cafeoil del ácido clorogénico con N2H4.H2O que podrían dar lugar a los potenciales productos de reacción antes descriptos. Se modificaron además con N2H4.H2O otros componentes de C. scolymus como rutina y luteolina. No se detectó actividad frente a la enzima tirosinasa luego del lavado de la reacción y sin mayor grado de purificación. Se halló un compuesto ubicuo, el cual se genera a partir de la reacción entre acetato de etilo (AcOEt) e N2H4.H2O durante el lavado de la reacción, motivo por el cual se modificó el protocolo de la reacción de hidracinólisis obviando lavados con AcOEt. En relación a este compuesto ubicuo se caracterizó haciendo experimentos de RMN de 1H, 13C, 15N, EM y espectroscopía IR. Todo esto condujo a que dicho compuesto es la diacetil hidrazida. La misma resultó activa frente a la enzima tirosinasa y no tiene citotoxicidad reportada. Diacetil hidrazida presentó una concentración que inhibe el 50% de la actividad enzimática (CI50) en 7.59 ± 0.75 μM, siendo 1,56 veces más activo que el inhibidor de referencia ácido kójico (CI50 = 11.97 ± 0.75 μM). Se evaluó además su citotoxicidad empleando líneas celulares VERO encontrando que hasta 200 μM no es citotóxico. Este experimento fue realizado en colaboración con el grupo del Dr. Esteban Serra.Con el objeto de analizar el efecto de la modificación química de los extractos sobre otras propiedades biomoleculares se aplicó un nuevo ensayo que permite detectar inhibidores del bromodominio TcBDF3. En cuanto a este ensayo biológico se halló actividad sobre el extracto de S. marianum bromado. Una de las subfracciones obtenidas, luego de realizar purificación por CC, recupera la actividad del extracto total. Se trabajó luego, con los componentes mayoritarios reportados para dicho extracto, que son el grupo de las silimarinas y taxifolina. Ambos se modificaron con bromo, resultando activa una fracción de purificación proveniente del grupo de las silimarinas bromadas, con una actividad del orden de la del inhibidor de bromodominios iBET-151. El ensayo de inhibición con proporciones en que el grupo de las silimarinas y taxifolina se hallan en el extracto (20:1, respectivamente), utilizando silimarina y taxifolina modificadas con bromo, indicó que la mezcla (20:1) es activa, pero en menor proporción que iBET-151. Esto sugiere que el grupo de las silimarinas bromadas sería responsable de la actividad.
Embargo
Aplicaciones biotecnológicas de bacterias del género Streptomyces
(2022) Bercovich, Bárbara Aylén; Rodríguez, Eduardo José
El género Streptomyces se encuentra ampliamente distribuido a través de ecosistemas terrestres y acuáticos, como saprófitos de vida libre como así también formando simbiosis con organismos eucariotas superiores. Esta diversidad ecológica se refleja en su potencial metabólico, ya que las actinobacterias son productores extremadamente versátiles de compuestos naturales con diferentes actividades de suma importancia para la salud humana, la agricultura y la industria biotecnológica. Es por eso, que en este trabajo nos propusimos caracterizar diferentes cepas de Streptomyces, y sus metabolitos bioactivos, con el fin de hallar y/o optimizar potenciales aplicaciones biotecnológicas de las mismas. En el primer capítulo de esta tesis, realizamos una búsqueda bioguiada partir de sobrenadantes de cultivos de actinobacterias que repriman la actividad del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ de Salmonella enterica serovar typhimurium. Este patógeno oportunista infecta múltiples hospedadores y causa gastroenteritis, siendo la causa más prevalente de enfermedades transmitidas por los alimentos en todo el mundo. Ante la rápida propagación de la resistencia a los antibióticos que la combaten, existe la necesidad de encontrar compuestos con mecanismos y modos de acción alternativos. El SDC PhoP/PhoQ de S. typhimurium controla la expresión de los genes no esenciales que le permiten a este patógeno internalizarse, sobrevivir y multiplicarse dentro de las células huésped. El hecho de que homólogos al SDC estén ausentes en mamíferos, han colocado a dicho sistema como objetivo clave en la búsqueda de compuestos con efecto de anti- virulencia. Mediante el uso de cepas reporteras de genes dependientes de SDC PhoP/PhoQ en un principio se obtuvieron al menos 7 sobrenadantes de actinobacterias que reprimían la actividad transcripcional de genes controlados por el PhoP. Luego, estudios con diferentes cepas reporteras permitieron seleccionar el sobrenadante de la cepa Streptomyces eurocidicus e identificarla azomicina como el compuesto bioactivo, responsable de la capacidad inhibitoria del SDC PhoP/PhoQ. Mediante estudios transcripcionales en diferentes cepas reporteras y mutantes se pudo determinar que dicho metabolito actúa de manera reversible y específica, a través de dos posibles mecanismos: uno, generando un estado periplasmático oxidante e involucrando a MgrB como inhibidora de la proteína sensora PhoQ; y otro, actuando directamente o indirectamente sobre PhoP, reprimiendo su capacidad como regulador de respuesta, de una manera independiente de PhoQ. Por otro lado, estudios celulares con cultivos de macrófagos RAW264.7 en presencia de azomicina mostrsaron la efectividad de este compuesto para inhibir la replicación intravacuolar de Salmonella dentro de estas células fagocíticas. Frenar este paso es indispensable para evitar la dispersión del patógeno bacteriano y alcanzar órganos vitales provocando infecciones sistémicas. Estos resultados reposicionan a la azomicina secretada por S. eurocidicus para diseñar una nueva terapia que trate las infecciones por Salmonella. Por otro lado, se ha demostrado que el género Streptomyces interacciona con organismos eucariotas superiores como es el caso de las plantas, formando parte de su rizósfera o endofíticamente. Esta interacción, puede promover y proteger su desarrollo a través de compuestos antimicrobianos (antibióticos, antifúngicos, insecticidas y/o antihelmínticos), hormonas vegetales, sideróforos que ayudan en la captación de Fe o facilitando la solubilización de fosfato, entre otras. El contacto de las bacterias con las plantas también puede proporcionar protección a las mismas a través de la activación de las vías de resistencia, induciéndole una capacidad defensiva mejorada frente a próximos ataques de patógenos. En este sentido, en el segundo capítulo analizamos las cepas Streptomyces eurocidicus y Streptomyces filipinensis, y sus productos naturales, como promotoras de crecimiento de plantas de soja (Glycine max (L.) Merr.) y como protectoras frente a diferentes hongos fitopatógenos que afectan dicho cultivo vegetal. Buscando ser una alternativa ecológica y superadora a los antifúngicos químicos comerciales utilizados, que resultan dañinos para el medio ambiente y para la salud. En este trabajo pudimos demostrar in vitro la producción de AIA y de sideróforos y la capacidad de solubilizar fosfato por parte de S. eurocidicus y S. filipinensis que pueden contribuir en el crecimiento y desarrollo de las plantas de soja. A su vez, determinamos que el agregado de estas cepas de Streptomyces genera efectos positivos en la germinación, emergencia y la nodulación primaria en maceta. Por otro lado, pudimos corroborar la promoción del crecimiento y desarrollo del cultivo de soja en invernadero, en estado vegetativo y reproductivo; que se vio traducido tanto en un incremento en el rendimiento del grano con respecto a las plantas sin tratar y a aquellas pre-tratadas con el antifúngico comercial, como en una mejora transgeneracional en la germinación y estado sanitario de las semillas obtenidas en la madurez de las plantas de soja pre-tratadas con S. eurocidicus. Asimismo, también se demostró la actividad antifúngica in vitro de los polienos eurocidina y filipina producidos por S. eurocidicus y S. filipinensis, respectivamente, frente a los patógenos fúngicos M. phaseolina, D. phaseolorum, F. tucumaniae, F. verticillioides, R. solani y C. graminícola. Luego se determino la protección de los cultivos de soja en tres patosistemas diferentesde las enfermedades de Podredumbre Carbonosa, Cancro de Tallo y Síndrome de Muerte Súbita. En todos los casos se obtuvo una reducción significativa de síntomas de dichas enfermedades al tratar las semillas con S. eurocidicus o S. filipinensis en comparación con los obtenidos para los tratamientos con la mezcla de antifúngicos comerciales utilizados como referencia o los controles sin tratar. Curiosamente, en estos ensayos de biocontrol se obtuvo la misma protección con el tratamiento de las cepas salvajes que con las cepas mutantes no productoras de los polienos. Por tanto, estos resultados sugieren que podrían estar implicados otros mecanismos más allá de la producción del compuesto antifúngico poliénico. Teniendo en cuenta la separación espacial y temporal de los tratamientos de Streptomyces y la infección por patógenos dada en el sistema soja-D. phaseolorum, este efecto de protección podría explicarse a través de un mecanismo de resistencia sistémica inducida en las plantas, aunque esta hipótesis debe ser confirmada. En conjunto, estos resultados sugieren que la promoción y el biocontrol ejercido por S. eurocidicus y S. filipinensis reducirían las pérdidas en cantidad y calidad de semillas por infecciones fúngicas en el cultivo de soja. Por tanto, la aplicación de este tratamiento ecológico y sustentable, podría ser una alternativa en el manejo de control integrado contra diversos patógenos. Si bien estos resultados, no pudieron replicarse por completo en el ensayo a campo realizado, queda pendiente la reiteración en otras campañas, región/es y/o con otra/s línea/s de semillas de soja.
Acceso Abierto
Aplicaciones biotecnológicas de los módulos de unión a carbohidratos de plantas
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-12-16) Grisolia, Mauricio Javier; Busi, María Victoria; Gómez Casati, Diego F.
En la degradación y remodelación de la pared celular intervienen numerosas enzimas y proteínas, y un aspecto común de la estructura de la mayoría de las mismas es su organización modular. Dicha organización incluye típicamente un dominio catalítico característico de cada enzima y uno o más dominios de unión a carbohidratos (CBM). Un CBM es definido como una secuencia contigua de aminoácidos dentro de una enzima activa involucrada en el metabolismo de carbohidratos, que posee la capacidad de unirse a los mismos. Hasta el momento, los CBM más estudiados corresponden a hongos y bacterias y se conoce muy poco de los de enzimas vegetales. Dentro de los CBM se destacan los dominios de unión a almidón (SBD). Desde abril de 2004 nuestro laboratorio trabaja en la caracterización de la almidón sintasa III (SSIII) de Arabidopsis thaliana (AT1G11720). Dicha proteína no había sido clonada ni caracterizada previamente. Los estudios preliminares mostraron que la porción amino terminal es portadora de tres regiones repetitivas con características de dominios SBD, hasta ese momento no descriptos en enzimas vinculadas con la síntesis de almidón, pertenecientes a la familia CBM53. Estudiando la capacidad de unión a distintos polisacáridos (almidón, amilosa, amilopectina, celulosa y xilanos) comprobamos que SBD123 tiene la capacidad de unirse a los cinco polisacáridos, dos de ellos componentes de la pared celular vegetal. Esto refleja la promiscuidad de tales dominios, ya que no sólo se unen a sustratos diferentes de su sustrato natural, sino que lo hacen con mayor avidez. Tales experimentos nos permitieron postular el uso de SBD123 como herramienta biotecnológica para modificar la estructura y/o el contenido de pared celular y de almidón de plantas. Para verificar nuestra hipótesis, se construyeron dos líneas de plantas transgénicas que sobreexpresan el extremo N-terminal de SSIII de A. thaliana específicamente en pared (E8-SBD123.1 y E8-SBD123.2) y que presentaron características fenotípicas destacables. Por lo tanto, se propusieron como objeto de estudio los dominios de unión a almidón (“Starch Binding Domains”, SBD, familia CBM53) de la almidón sintasa III de Arabidopsis thaliana y los CBM de ATXYN1, una endo-1,4-beta-xilanasa también de A. thaliana (familia CBM22). El abordaje fue llevado a cabo, utilizando análisis bioinformáticos, evolutivos e ingeniería de proteínas, así como técnicas moleculares y fisiológicas que nos brindaron información sobre su bioquímica, estructura y función y de su rendimiento o in vitro o in vivo como herramienta biotecnológica. En primer lugar, realizamos una caracterización de los parámetros fenotípicos de las plantas E8-SBD123 observando un aumento general en el tamaño y en la biomasa de dichas plantas en comparación con Col-0, además de una modificación en los parámetros de crecimiento reproductivo (tasa elongación del tallo, proporción de tallo y la longitud del hipocótilo). Estos parámetros se encuentran asociados a la etapa de crecimiento reproductivo, gobernada por la auto-preservación del SAM (meristema apical del tallo) por proliferación celular y la extensión del tallo por expansión celular. Sin embargo, no se observaron diferencias en la longitud del hipocótilo cuando las plántulas fueron sometidas a oscuridad continua. Adicionalmente se determinó que existe un aumento en la tasa de crecimiento, confirmado por técnicas de microscopía óptica. En el caso de las hojas, observamos que un aumento del 20% en el área foliar en las plantas transgénicas puede ser explicado solamente por un aumento del 20% del área celular promedio, no siendo significativa la contribución del número celular. Adicionalmente, observamos alteraciones en la composición de la pared celular de las plantas transgénicas en distintos órganos. Específicamente observamos aumento en los niveles de hemicelulosas y pectinas, los cuales pueden deberse a una respuesta de la planta para soportar las fuerzas de tensión. Por último, detectamos que estas plantas son capaces de producir mayor cantidad de azúcares fermentables en comparación con Col-0. Debido a que utilizamos a los SBD de la SSIII para alterar la estructura de la pared celular, y a que los precursores para la síntesis de celulosa y almidón son compartidos, decidimos evaluar los niveles de almidón transitorio y sacarosa, en hojas de las plantas de A. thaliana transformadas. Para esto, determinamos el contenido de almidón en función del tiempo, encontrando una disminución significativa a mitad del día en las líneas E8-SDB123.1 y E8-SDB123.2. Además, detectamos una variación en la relación amilosa/amilopectina. Por medio de TEM (microscopía electrónica de trasmisión), no pudimos determinar diferencias en el número de gránulos de almidón por cloroplastos, pero si una alteración en la forma y tamaño de los gránulos de almidón. Adicionalmente, se evidenció una disminución significativa en la actividad almidón sintasa total, y un aumento en la actividad de enzimas como la sacarosa sintasa (SUS) y la invertasa ácida (IA) en ambas líneas transgénicas, en comparación con la línea control. De esta forma, proponemos que el aumento en la actividad IA puede actuar como fuerza motriz de la expansión celular informada en las plantas transgénicas, y que tanto la alteración en la composición de la pared, como el aumento en la biomasa observado en las líneas transgénicas, pueden explicar un aumento en la demanda de azúcares en el apoplasto y, en consecuencia, un aumento en la actividad SUS.
Acceso Abierto
Aplicaciones modernas de la catálisis mediada por metales de transición a la generación de diversidad molecular
(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-10-31) Traficante, Carla Inés; Mata, Ernesto Gabino
Las reacciones de acoplamiento cruzado se han establecido en los últimos años como una herramienta fundamental dentro de las estrategias de síntesis orgánica, especialmente para la formación de enlaces carbono-carbono y carbono-heteroátomo. Por otra parte, un método de gran utilidad para la síntesis orgánica de alta eficiencia y para la generación de diversidad molecular en general, es la síntesis orgánica en fase sólida. En este trabajo de Tesis Doctoral nos enfocamos en el desarrollo de nuevos procesos de catálisis mediados por metales de transición aplicados especialmente a la química sobre soporte sólido para la obtención de compuestos de interés biológico. La primera etapa de nuestra investigación se focaliza en el estudio de la reacción de acoplamiento cruzado de Hiyama en fase sólida y la preparación de una quimioteca de biarilos obtenidos aplicando condiciones optimizadas de dicha reacción. En la siguiente etapa de nuestro trabajo, se detallan los resultados obtenidos del análisis de diferentes factores que afectan la eficiencia de esta reacción, haciendo especial énfasis en el efecto de la adición de CuI y una pequeña cantidad de agua a las condiciones de reacción. En esta etapa del trabajo de Tesis se ha logrado preparar una quimioteca de biarilos, incluso con heteroátomos en su estructura, y compuestos de mayor complejidad estructural, como las 4-biaril-β-lactamas. En la última etapa de este trabajo, se desarrolló una estrategia en fase sólida para la generación rápida de una quimioteca de E-estilbenos, basada en una combinación en tándem de acoplamientos cruzados catalizados por paladio, particularmente las reacciones de Hiyama y Heck.
Acceso Abierto
Aspectos fisiológicos del metabolismo de esteroles en Tetrahymena thermophila
(2019) Hernández, Josefina; Uttaro, Antonio Domingo
Tetrahymena thermophila es un ciliado de vida libre, aerobio y fagótrofo, que habita en fuentes de agua dulce de clima templado. La cubierta de cilias que posee en la totalidad de su superficie le permite movilizarse y alimentarse, y una compleja estructura interna le confiere resistencia y flexibilidad. Las membranas de T. thermophila poseen un hopanoide denominado tetrahymanol en lugar de los esteroles conocidos en otros eucariotas; sin embargo, cuando encuentra esteroles en su medio de crecimiento, los incorpora y los modifica tanto por desetilación -en el caso de ser fitoesteroles- como por adición de dobles enlaces en posiciones 5(6), 7(8) y 22(23). El compuesto final tri-insaturado, llamado 7,22-bis dehidrocolesterol, eventualmente reemplaza al tetrahymanol en la membrana. En este trabajo de tesis, particularmente se abordaron los mecanismos involucrados en la internalización de esteroles, y en las vías de señalización que conducen al cambio en la expresión de las enzimas involucradas. Por medio de videos digitales de alta resolución se comprobó que las células de T. thermophila suplementadas con colesterol aumentan inmediatamente la velocidad promedio de nado, de tipo lineal. Este efecto es característico de quimio-atrayentes, siendo la primera vez que se demuestra un comportamiento similar frente a esteroles. También se observó un mayor número de células en el estado estacionario de cultivos crecidos con colesterol, indicando un posible efecto mitogénico. Evidenciamos una modulación transcripcional generalizada en cultivos de T. thermophila suplementados con colesterol. Analizando el transcriptoma de estas células, obtenido por RNAseq, identificamos 177 genes inducidos y 179 genes reprimidos significativamente (genes diferencialmente expresados, o GDE). Sólo tres de los cuatro genes que codifican para las desaturasas de esteroles se encuentran inducidos. La mayor parte de los genes involucrados en la síntesis de tetrahymanol se encuentran reprimidos, confirmando que dicha síntesis es regulada principalmente a nivel transcripcional. Entre otros genes identificados figuran algunos presumiblemente involucrados en el transporte de esteroles y en mecanismos de señalización celular. Los resultados de RNAseq se validaron por medio de la técnica RT-qPCR. El patrón de expresión de los GDE seleccionados es consistente entre ambas metodologías, demostrando la confiabilidad de los datos de RNAseq. La técnica de RT-qPCR, además, fue utilizada como una herramienta para evaluar los cambios a nivel transcripcional de cultivos de T. thermophila sometidos a diferentes tratamientos, utilizando algunos de los GDE como “reporteros” de inducción/represión. En primera instancia, se ensayaron compuestos comerciales conocidos por afectar vías de señalización canónicas. La intención fue encontrar paralelismos en su accionar que pudieran dar un indicio sobre las vías de traducción de señales gatilladas por colesterol. De los numerosos compuestos probados, sólo cuatro ejercieron un efecto significativo, antagónico al colesterol. En otros modelos celulares, estas drogas inhiben la acción de fosfolipasas y/o kinasas; sin embargo, en T. thermophila no hemos observado diferencias en los patrones de fosforilación de proteínas producidos por colesterol, droga, o una combinación de ambos. Sus blancos son, entonces, diferentes a los reportados para los modelos animales. En todos los casos, el efecto sobre el gen reportero de represión fue total, mientras que sobre el de inducción fue parcial, lo que da cuenta de la existencia de al menos dos vías de señalización diferentes para estos grupos de genes. Las siguientes preguntas por resolver fueron cómo ocurre la internalización y compartimentalización de los esteroles, y cómo estos procesos se asocian a las señales que desencadenan la regulación transcripcional. Un trabajo reportado por otros autores utilizando la cepa deficiente en fagocitosis T. thermophila II8G-IA sugería que la incorporación de esteroles ocurre únicamente por fagocitosis. Se utilizó la misma mutante en comparación con la cepa salvaje para (a) observar la actividad transcripcional frente a colesterol, (b) detectar la producción de esteroles modificados, y (c) describir las vías de incorporación de esteroles. Empleamos para algunos de estos fines Citocalasina D (CytD), inhibidor de la endocitosis dependiente de actina, y U18666A, inhibidor de la proteína NPC1, encargada del egreso de colesterol desde los endolisosomas hacia otras organelas, como el retículo endoplasmático (RE). Comprobamos así que existen dos vías de incorporación, ambas dependientes de actina: una fagocítica, en la cual la acumulación de colesterol es masiva y a cortos tiempos, y otra endocítica (evidenciable en la mutante), más lenta, aunque sostenida en el tiempo. En contraste con la cepa salvaje, en la cepa mutante II8G-IA el colesterol no es modificado hacia los derivados insaturados. En los perfiles de lípidos de ambas cepas incubadas con 14C-colesterol se distinguen bandas de ésteres de esteroles, evidenciando su pasaje por RE -donde reside la enzima responsable de la esterificación, la acil-CoA transferasa-. No se observan esteroles acilados cuando se agrega U18666A al medio; este compuesto inhibiría a una proteína similar en función a NPC1 de este ciliado, impidiendo la salida de colesterol desde los endolisosomas, y consecuentemente, su llegada al RE. En la cepa mutante, sólo el grupo de GDE inducibles responden a colesterol. Por ende, el ingreso del esterol por fagocitosis es clave para la represión de genes. Esto es coherente con la existencia de dos vías de señalización distintas planteadas anteriormente. Tanto CytD como U18666A ejercen un efecto antagónico al colesterol sobre los GDE de ambas cepas. Las señales por colesterol se generarían entonces en compartimentos intracelulares, y no en la membrana plasmática, de forma similar a lo que ocurre en eucariotas superiores.

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