Examinando por Autor "Armas, Pablo"
Mostrando 1 - 7 de 7
Resultados por página
Opciones de ordenación
Ítem Acceso Abierto Beyond the binding site: In vivo Identification of tbx2, smarca5 and wnt5b as molecular targets of CNBP during embryonic development(Public Library of Science, 2013-05-07) Armas, Pablo; Margarit, Ezequiel; Mouguelar, Valeria; Allende, Miguel L.; Calcaterra, Nora B.CNBP is a nucleic acid chaperone implicated in vertebrate craniofacial development, as well as in myotonic dystrophy type 2 (DM2) and sporadic inclusion body myositis (sIBM) human muscle diseases. CNBP is highly conserved among vertebrates and has been implicated in transcriptional regulation; however, its DNA binding sites and molecular targets remain elusive. The main goal of this work was to identify CNBP DNA binding sites that might reveal target genes involved in vertebrate embryonic development. To accomplish this, we used a recently described yeast one-hybrid assay to identify DNA sequences bound in vivo by CNBP. Bioinformatic analyses revealed that these sequences are G-enriched and show high frequency of putative G-quadruplex DNA secondary structure. Moreover, an in silico approach enabled us to establish the CNBP DNA-binding site and to predict CNBP putative targets based on gene ontology terms and synexpression with CNBP. The direct interaction between CNBP and candidate genes was proved by EMSA and ChIP assays. Besides, the role of CNBP upon the identified genes was validated in loss-of-function experiments in developing zebrafish. We successfully confirmed that CNBP up-regulates tbx2b and smarca5, and down-regulates wnt5b gene expression. The highly stringent strategy used in this work allowed us to identify new CNBP target genes functionally important in different contexts of vertebrate embryonic development. Furthermore, it represents a novel approach toward understanding the biological function and regulatory networks involving CNBP in the biology of vertebrates.Ítem Acceso Abierto CNBP controls transcription by unfolding DNA G-quadruplex structures(Oxford University Press, 2019-06-20) David, Aldana P.; Pipier, Angélique; Pascutti, Federico; Binolfi, Andrés; Weiner, Andrea María Julia; Challier, Emilse; Heckel, Sofía; Calsou, Patrick; Gomez, Dennis; Calcaterra, Nora B.; Armas, PabloÍtem Acceso Abierto Cuádruplex de guanina y el desarrollo embrionario de los vertebrados(2019) David, Aldana P.; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.Los cuádruplex de guanina (G4s) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de G4s en organismos multicelulares y del rol de los mismos en la regulación transcripcional in vivo. Para abordar esta temática, se estudió la función de los G4s en la regulación transcripcional de genes involucrados en el desarrollo embrionario de vertebrados. Para esto se realizó una búsqueda in silico de secuencias con potencialidad de formar G4s (PQSs) conservadas dentro de las regiones promotoras proximales de genes de humano, ratón y pez cebra involucrados en el desarrollo embrionario. Las PQSs presentes en los promotores de los genes nog, col2a1 y fzd5 se seleccionaron entre aquellas capaces de plegarse in vitro como G4s para ensayar su funcionalidad como reguladores transcripcionales en ensayos in cellulo en células Neuro2a e in vivo en embriones de pez cebra. Los G4s seleccionados no solo fueron capaces de modular la transcripción, sino que la interrupción in vivo de los G4s en embriones de pez cebra en desarrollo resultó en fenotipos similares a los reportados para la reducción de la expresión de los genes analizados. En particular, la interrupción del G4 de nog3 ocasionó malformaciones craneofaciales consistentes con la función del gen en el desarrollo. A continuación, se estudió la función de la proteína celular de unión a ácidos nucleicos (CNBP) sobre la regulación transcripcional mediada por G4. CNBP es una chaperona de ácidos nucleicos capaz de interaccionar con secuencias ricas en guanina que es esencial para el correcto desarrollo craneofacial. Un análisis in silico predijo que los G4s que controlan la transcripción del gen humano y de pez cebra de nog (NOG- G4 y nog3-G4, respectivamente) se solapan con la secuencia de unión al ADN de CNBP. Ensayos in vitro mostraron que CNBP es capaz de desplegar las estructuras NOG-G4 y nog3-G4. Ensayos in cellulo en células HeLa e in vivo en embriones de pez cebra revelaron un rol represor de CNBP sobre la transcripción de nog, probablemente mediada por la desestructuración de los G4s. Finalmente, se determinó la actividad de CNBP sobre la transcripción de protooncogenes regulados por G4s en sus promotores, identificando a KRAS como un nuevo blanco de activación transcripcional de CNBP a través de la desestructuración de G4s. Este trabajo revela el rol transcripcional que cumplen G4s evolutivamente conservados durante el desarrollo embrionario, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de una proteína capaz de desarmar estructuras G4 introduciendo nuevos genes blancos para la misma y reafirmando la importancia de las proteínas moduladoras de G4s sobre la función biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.Ítem Acceso Abierto G-quadruplexes as novel cis-elements controlling transcription during embryonic development(Oxford University Press, 2016-01-14) David, Aldana P.; Margarit, Ezequiel; Domizi, Pablo; Banchio, Claudia; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.G-quadruplexes are dynamic structures folded in G-rich single-stranded DNA regions. These structures have been recognized as a potential nucleic acid based mechanism for regulating multiple cellular processes such as replication, transcription and genomic maintenance. So far, their transcriptional role in vivo during vertebrate embryonic development has not yet been addressed. Here, we performed an in silico search to find conserved putative G-quadruplex sequences (PQSs) within proximal promoter regions of human, mouse and zebrafish developmental genes. Among the PQSs able to fold in vitro as G-quadruplex, those present in nog3, col2a1 and fzd5 promoters were selected for further studies. In cellulo studies revealed that the selected G-quadruplexes affected the transcription of luciferase controlled by the SV40 nonrelated promoter. G-quadruplex disruption in vivo by microinjection in zebrafish embryos of either small ligands or DNA oligonucleotides complementary to the selected PQSs resulted in lower transcription of the targeted genes. Moreover, zebrafish embryos and larvae phenotypes caused by the presence of complementary oligonucleotides fully resembled those ones reported for nog3, col2a1 and fzd5 morphants. To our knowledge, this is the first work revealing in vivo the role of conserved G-quadruplexes in the embryonic development, one of the most regulated processes of the vertebrates biology.Ítem Acceso Abierto Genetic variations in G-quadruplex forming sequences affect the transcription of human disease-related genes(Oxford University Press, 2023-11-01) Lorenzatti, Agustín; Piga, Ernesto José; Gismondi, Mauro; Binolfi, Andrés; Margarit, Ezequiel; Calcaterra, Nora B.; Armas, PabloGuanine-rich DNA strands can fold into non-canonical four-stranded secondary structures named G-quadruplexes (G4s). G4s folded in proximal promoter regions (PPR) are associated either with positive or negative transcriptional regulation. Given that single nucleotide variants (SNVs) affecting G4 folding (G4-Vars) may alter gene transcription, and that SNVs are associated with the human diseases’ onset, we undertook a novel comprehensive study of the G4-Vars genome-wide (G4-variome) to find disease-associated G4-Vars located into PPRs. We developed a bioinformatics strategy to find disease-related SNVs located into PPRs simultaneously overlapping with putative G4-forming sequences (PQSs). We studied five G4-Vars disturbing in vitro the folding and stability of the G4s located into PPRs, which had been formerly associated with sporadic Alzheimer’s disease (GRIN2B), a severe familiar coagulopathy (F7), atopic dermatitis (CSF2), myocardial infarction (SIRT1) and deafness (LHFPL5). Results obtained in cultured cells for these five G4-Vars suggest that the changes in the G4s affect the transcription, potentially contributing to the development of the mentioned diseases. Collectively, data reinforce the general idea that G4-Vars may impact on the different susceptibilities to human genetic diseases’ onset, and could be novel targets for diagnosis and drug design in precision medicine.Ítem Acceso Abierto Insights into vertebrate head development: from cranial neural crest to the modelling of neurocristopathies(UPV/EHU Press, 2020-08-27) Weiner, Andrea María Julia; Coux, Gabriela; Armas, Pablo; Calcaterra, Nora B.Ítem Embargo Variantes genéticas en secuencias formadoras de cuádruplex de guanina: consecuencias sobre la expresión de genes asociados a patologías humanas(2023) Piga, Ernesto José; Armas, PabloLos cuádruplex de guanina (G4) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. En particular, existe gran cantidad de evidencia sobre la regulación de genes asociados al desarrollo de patologías humanas mediada por G4, principalmente de proto-oncogenes. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de las variantes genéticas presentes en las secuencias con capacidad de formar G4 (sG4), y el efecto que las mismas generaban sobre los G4. Por este motivo decidimos investigar si las SNV (de las siglas del término en inglés single nucleotide variants) presentes en los G4 podrían contribuir a la expresión génica diferencial entre individuos que pueda conducir a la predisposición o al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esto se realizó una búsqueda y selección bioinformática de SNV en secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) localizadas en regiones reguladoras de la transcripción de genes asociados con patologías humanas. Realizamos una búsqueda bibliográfica orientada en dos ejes. El primero fue buscar SNV-sG4 asociadas a variaciones transcripcionales reportadas en la literatura, y el segundo eje se enfocó en la búsqueda de sG4 en regiones promotoras proximales y con funciones en la regulación de la transcripción de proto-oncogenes reportados en la bibliografía y la posterior identificación de SNV presentes en esas sG4. Los resultados de la búsqueda rindieron 14 genes con 88 SNV-sG4 presentes en ellos. Luego se analizaron las secuencias de las sG4 utilizando predictores bioinformáticos de G4 para comparar y seleccionar 43 SNV-sG4 de 14 genes que podrían generar mayores cambios en la capacidad de formación de G4. Para caracterizar el efecto de las SNV-sG4 seleccionados en la formación y/o estabilidad de los G4 realizamos diversas técnicas bioquímicas y espectroscópicas in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos. Esto nos permitió restringir la selección a 12 SNV-sG4 de 4 genes, que fueron los que evidenciaron cambios significativos en la formación y estabilidad del G4. Por último, evaluamos las consecuencias de las SNV-sG4 que afecten la formación y/o estabilidad de los G4 sobre la expresión génica transcripcional en el contexto celular. Para ello se clonaron las sG4 en un sistema de gen reportero, corriente arriba del promotor básico (SV40) que regula el gen que codifica a la luciferasa de luciérnaga en el plasmídico pGL3- Promoter Vector (pGL3-PV, Promega). Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular humana Human Embrionic Kidney o HEK-293 y se evaluaron los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Pudimos observar variaciones significativas en los niveles de actividad del reportero regulado por el promotor SV40 en presencia de las SNV en comparación con las sG4. También, utilizando la regulación transcripcional del proto-oncogen c-MYC mediada por G4 como modelo de estudio, se analizó el efecto de las SNV-sG4 en el contexto del promotor mediante el clonado de un fragmento 850 pb (pares de bases), (-337/+513 respecto del sitio de inicio de la transcripción o TSS) del promotor del gen, el cual contiene a la sG4, y la generación de las SNV-sG4 en estudio para esa sG4. Las construcciones fueron transfectadas en HEK293 evaluando los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Como resultado de la transfecciones pudimos observar variaciones significativas de la actividad del reportero para algunas de las SNV-sG4, respecto a la versión WT (wild type). Estas evidencias nos permitieron inferir que la presencia de ciertas variantes estaría influyendo en los niveles de expresión del gen reportero regulado por el promotor de c-MYC en las construcciones plasmídicas. Colectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis aportan nuevas evidencias sobre el efecto de las SNV presentes en las sG4 sobre la formación de G4, tanto de manera bioinformática como in vitro, y su influencia en la regulación de los niveles de transcripción en un contexto celular. Los resultados recogidos en este trabajo sugieren que las SNV-sG4 que alteran el plegamiento de G4 pueden ser la causa de la expresión diferencial de genes y podrían considerarse como un nuevo mecanismo de etiología molecular para la predisposición o el establecimiento de patologías humanas, como el cáncer en el caso de los oncogenes.